Summary

Transplants concurrentiels pour l'évaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme

Published: August 31, 2016
doi:

Summary

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Abstract

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

Introduction

Hématopoïèse est un processus de régénération qui assure la reconstitution des cellules sanguines qui ont été perdus à cause de blessures, le rayonnement et la mort cellulaire. Ce procédé est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (HSC) qui résident en grande partie dans la moelle osseuse adulte. En outre, les cellules souches hématopoïétiques peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques dans les maladies auto – immunes, des affections malignes hématologiques et de déficiences immunitaires 1. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la fonction HSC, y compris leur expansion proliférative et leur capacité à atteindre et engraft l'os receveur après la greffe osseuse. Bien que des études récentes ont rapporté plusieurs marqueurs de surface cellulaire, y compris les membres de la famille SLAM CD150 et CD48, pour enrichir prospectivement CSH adultes et CSH fœtales à environ 50% de pureté 2-4, la mesure standard d'or pour CSH fonctionnelle reste un test repeupler in vivo déterminer leur capacité à rétablir le sang cproduction ell dans un hôte irradié 5.

L'essai de repopulation clonale in vivo a été initialement développé par Till et McCulloch 6 et a depuis été affiné et étendu. Comme défini à l'origine, les CSH assurer la production de cellules sanguines à vie grâce à l'auto-renouvellement et la différenciation. Le transfert de CSH dans un destinataire irradié nous permet donc d'évaluer: leur capacité à se différencier grâce à l'analyse des différentes lignées de cellules sanguines (lymphocytes T, les lymphocytes B, les granulocytes, les monocytes) et leur capacité d'auto-renouvellement par la transplantation de série. L'essai devrait normalement impliquer la comparaison de la fonctionnalité et / ou de la quantité de deux populations de CSH, par exemple, les cellules provenant de deux souris de différents génotypes ou des cellules qui ont été traitées ou non traitées avec différents facteurs qui pourraient influer sur le maintien ou l' expansion de CSH en culture. chimérisme du donneur, ou la contribution des donateurs transférés CSH to la production de cellules sanguines peut alors être déterminée par analyse par cytométrie de flux dans le sang périphérique et la moelle osseuse en utilisant des marqueurs de surface cellulaire ou d'autres méthodes qui permet de distinguer les cellules du donneur dans le receveur, ou l'hôte. Les marqueurs les plus utilisés sont certainement les deux allèles du gène PTPRC ou de l' antigène CD45 leucocytaire 7 que nous avons choisi pour les exemples fournis ci – dessous.

L'essai de repopulation clonale peut être soit concurrentiel ou non concurrentiel. Dans un contexte non compétitif, CQH de contrôle et de test sont transférés dans des souris receveuses distinctes et les résultats pour chaque type de cellule est indépendant de l'autre. Dans un contexte concurrentiel, la fonction des deux essais et de contrôle CSH est mesuré par rapport à une population de concurrent CSH. Le protocole décrit ici utilise le paramètre concurrentiel, mais peut également être adapté pour les situations non concurrentielles. Les deux approches ont leurs avantages et leurs limites, et nous allons les comparer en détail dans lediscussion. Nous décrivons également des approches différentes pour assurer l'équité dans le nombre de transplantés CSH, expliquer comment adapter le dosage pour la quantification des CSH en limitant essai de dilution (LDA), et de fournir des exemples des deux greffes réussies ou non pour l'interprétation des résultats.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le comité institutionnel de l'éthique animale et de suivre le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux. Note: Pour maintenir des conditions stériles / spécifiques exempts d'agents pathogènes logement, effectuer toutes les procédures impliquant la manipulation directe des souris vivantes à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique ou une hotte à …

Representative Results

Une description générale de la mise en transplantation concurrentielle, y compris les greffes secondaires (voir plus loin) peut être trouvée dans la figure 1. Une analyse représentative pour l' os pré-greffe osseuse CSH peut être trouvée dans la figure 2. Des informations plus détaillées sur l'exclusion des doublets et les cellules mortes peuvent être trouvées ailleurs 9. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-…

Discussion

Le protocole décrit ici est conçu pour évaluer l'aptitude relative des donateurs (test) CSH contre concurrent connu CSH. La situation de la concurrence augmente la sensibilité relative de l'essai (plus susceptibles de détecter des baisses modérées dans la condition physique des cellules souches) et fournit un contrôle technique interne pour l'efficacité de l'irradiation et de l'injection. Cependant, il ne doit pas être utilisé comme une mesure absolue de HSC remise en forme; une diminution…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Roxann Hétu-Arbour pour l'aide à la conception de la figure et la démonstration des procédures. La recherche dans le laboratoire a été soutenu par une bourse de transition de la Fondation Cole, Découverte accorde pas. 419226-2012 du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et la Fondation canadienne pour l'innovation (FCI Leaders Fund accorde. 31377 pas). KMH est un junior chercheur-boursier du Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).

Materials

Microtainer tubes with K2EDTA BD Biosciences 365974
20G needle BD Syringe For blood sampling from the mandibular vein
LabQuake Shaker rotisserie Thermo  Scientific C415110 Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) BD Biosciences 2.50 553142 Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) 
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 0.25 25-0031 For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) eBioscience 0.25 12-0193
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 0.25 47-5931
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) eBioscience 2.50 11-0453
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) eBioscience 1.00 48-0454
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) eBioscience 1.25 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 1.25 13-0031
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 1.25 13-0112
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 1.25 13-5931
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) eBioscience 0.63 13-5921
V500 streptavidin BD Biosciences 0.50 561419
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) BD Biosciences 0.25 553355
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) BD Biosciences 0.25 558162
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) eBioscience 0.50 46-1351
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) Biolegend 0.63 115918 BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone
1ml tuberculin syringe with 27G needle BD Syringe 309623
1ml tuberculin syringe with 25G needle BD Syringe 309626
70 um cell strainer BD Falcon 352350

References

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Cite This Article
Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M. Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness. J. Vis. Exp. (114), e54345, doi:10.3791/54345 (2016).

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