Summary

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

Published: August 31, 2016
doi:

Summary

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Abstract

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

Introduction

Hämatopoese ist ein regenerativer Prozess, der das Auffüllen von Blutzellen gewährleistet, dass durch Verletzungen, Strahlung und Zelltod verloren. Dieser Prozess wird von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) gewährleistet, die im erwachsenen Knochenmark weitgehend befinden. Zusätzlich können hämatopoetische Stammzellen für therapeutische Zwecke in Autoimmunerkrankungen, hämatologischen Malignitäten und Immundefizienz 1 verwendet werden. Es besteht somit ein Bedarf nach besser, die Mechanismen zu verstehen, die HSC-Funktion regulieren, einschließlich ihrer proliferative Expansion und ihre Fähigkeit, den Empfängerknochenmark nach der Transplantation zu erreichen und engraft. Obwohl neuere Studien mehrere Zelloberflächenmarker berichtet haben, einschließlich der SLAM Familienmitglieder CD150 und CD48, prospektiv erwachsenen HSZ und fetale HSZ auf ca. 50% Reinheit 2-4, der Goldstandard Maß für die funktionelle HSZ bleibt ein in vivo repopulating Test bereichern bestimmen ihre Fähigkeit, den Blut c wieder herzustellenell Produktion in einem bestrahlten Host 5.

Die in vivo klonalen repopulating Test wurde zunächst von Till und McCulloch 6 entwickelt und verfeinert und erweitert seitdem. Wie ursprünglich definiert, sorgen HSZ lebenslangen Blutkörperchen durch Selbsterneuerung und Differenzierung. Die Übertragung von HSCs in eine bestrahlte Empfänger ermöglicht uns so beurteilen zu: ihre Fähigkeit, durch die Analyse der verschiedenen Blutzelllinien (T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten) und ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung durch serielle Transplantation zu differenzieren. Der Assay würde beinhalten in der Regel den Vergleich der Funktionalität und / oder der Menge der zwei Populationen von HSCs, beispielsweise Zellen von zwei Mäusen verschiedener Genotypen oder Zellen kommen , die mit verschiedenen Faktoren behandelt oder unbehandelt sind, die die Wartung oder Expansion von HSCs beeinflussen könnten in Kultur. Spenderchimerismus oder der Beitrag der übertragenen Spender HSZ to Blutzellproduktion kann dann mittels Durchflusszytometrie Analyse im peripheren Blut und Knochenmark unter Verwendung von Zelloberflächenmarker oder andere Verfahren bestimmt werden, die Spenderzellen des Empfängers wird zu unterscheiden, oder Host. Die am häufigsten verwendeten Marker sind sicherlich die beiden Allele des Gens oder Protein-Tyrosinphosphatase CD45 Leukozyten – Antigen 7 , die wir für die Beispiele unten angegeben gewählt.

Die klonalen Neubesiedlung Test kann entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. In einer nicht-kompetitiven Einstellung, Kontrolle und Prüfung HSCs werden in getrennte Empfängermäuse übertragen und das Ergebnis für jeden Zelltyp wird von der anderen unabhängig sein. In einem kompetitiven Einstellung wird die Funktion sowohl Test- und Kontroll HSCs gegen eine Population von Kompetitor HSCs gemessen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Wettbewerbs Einstellung kann aber auch für nicht-kompetitiven Situationen angepasst werden. Beide Ansätze haben ihre Vor- und Nachteile, und wir werden sie im Detail in der VergleichsDiskussion. Wir beschreiben auch verschiedene Ansätze Eigenkapital in der Zahl der transplantierten HSZ, um sicherzustellen, erklären, wie der Test für die Quantifizierung von HSZ anzupassen, indem Verdünnungsanalyse Begrenzung (LDA), und beide Beispiele für die Interpretation der Ergebnisse erfolgreichen und nicht erfolgreichen Transplantationen zur Verfügung stellen.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von der institutionellen Tierethikkommission und folgen dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien zugelassen. Hinweis: Um steril / specific pathogen freien Gehäuse Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen alle Verfahren im Zusammenhang mit Direkt Umgang mit lebenden Mäusen in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einem Laminar-Flow-Haube. Reinigen oder sterilisieren Käfige, Haltevorrichtungen, Gehäusematerialien, Futter un…

Representative Results

Eine allgemeine Beschreibung der Wettbewerbs Transplantation Einstellung, einschließlich der sekundären Transplantationen (weiter unten erörtert) in Abbildung 1 zu entnehmen. Eine repräsentative Analyse vor der Transplantation des Knochenmarks HSZ in 2 zu . Nähere Informationen über den Ausschluss von Dubletten zu finden und tote Zellen können an anderer Stelle 9. Fig…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die relative Eignung der Spender (Test) HSZ gegen bekannte Wettbewerber HSZ zu bewerten. Die Konkurrenzsituation erhöht die relative Empfindlichkeit des Assays (eher moderate Abnahme der Stammzell Fitness zu erkennen), und stellt eine interne technischen Kontrolle für die Wirksamkeit der Bestrahlung und Injektion. Es sollte jedoch nicht als absolutes Maß für HSC Fitness verwendet werden; nicht gut in der Abwesenheit von Konkurrenz eine Abnahme der Wettbewerbs Reko…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar, dass Roxann Hétu-Arbour für die Unterstützung bei der Abbildung Design und Demonstration der Verfahren. Die Forschung im Labor durch eine Transition Award von der Cole-Stiftung unterstützt wurde, gewähren Discovery-Nr. 419226-2012 aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) und der Canada Foundation for Innovation (CFI Leaders Fund nicht gewähren. 31377). KMH ist ein Chercheur-Boursier Junior für den Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).

Materials

Microtainer tubes with K2EDTA BD Biosciences 365974
20G needle BD Syringe For blood sampling from the mandibular vein
LabQuake Shaker rotisserie Thermo  Scientific C415110 Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) BD Biosciences 2.50 553142 Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) 
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 0.25 25-0031 For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) eBioscience 0.25 12-0193
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 0.25 47-5931
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) eBioscience 2.50 11-0453
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) eBioscience 1.00 48-0454
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) eBioscience 1.25 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 1.25 13-0031
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 1.25 13-0112
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 1.25 13-5931
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) eBioscience 0.63 13-5921
V500 streptavidin BD Biosciences 0.50 561419
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) BD Biosciences 0.25 553355
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) BD Biosciences 0.25 558162
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) eBioscience 0.50 46-1351
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) Biolegend 0.63 115918 BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone
1ml tuberculin syringe with 27G needle BD Syringe 309623
1ml tuberculin syringe with 25G needle BD Syringe 309626
70 um cell strainer BD Falcon 352350

References

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Cite This Article
Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M. Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness. J. Vis. Exp. (114), e54345, doi:10.3791/54345 (2016).

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