"Phagosome 폐쇄 분석은"사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
식균 작용은 인식을하고 섭취 재료의 국제화 및 저하로 연결하는 수용체를 표면 재료의 결합을 시작하는 중요한 세포 기능이다. 이러한 금형 Dictyostelium의 discoideum 및 아메바 같은 단세포 진핵 생물은 박테리아에 공급하는 식균 작용을 사용하는 반면, 고등 생물 전문 세포로 진화했다. 대 식세포 또는 수지상 세포는 다양한 조직과 기관의 병원균에 대한 방어의 첫 번째 라인이며, 항원 제시 및 사이토 카인 생산 1-4을 통해 적응 면역 체계를 활성화 할 중요하다. 특정 상황에서 식균 작용은 비전문가 탐식 세포, 예컨대, 내피 세포 및 상피 세포에 의해 수행 될 수있다. 이 과정은 개발 과정과 정상 조직의 매출과 리모델링에 대한 성인의 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 이러한 고환 또는 망막의 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 같은 마지막으로, 전문 식세포색소 상피 세포는 매우 강력한 식세포 5입니다.
phagosome의 형성은 어디 미생물이나 세포 파편의 저하는 탐식 세포의 표면에 식세포 수용체의 클러스터링 시작을 발생합니다. 이러한 Fc 수용체 FCR () 또는 보완 수용체 (CR을) 등의 옵 소닌 수용체의 클러스터링을 다음과 같은 다운 스트림 신호 이벤트가 아니라 특징으로하고있다. 그러나, 수신자 같은 수용체 (TLR에), 렉틴, 만노스 수용체와 스 캐빈 저 수용체 등 다양한 비 옵 소닌 수용체도 있습니다. 이들 수용체는 만노스 또는 푸 코스 잔기, 포스파티딜 세린, 및 리포 폴리 사카 라이드 1,6-9로서 입자 표면에 결정을 인식한다.
병원체 또는 세포 파편 인식에 다음 강렬하고 과도 굴지 리모델링으로 이어질 식세포 수용체의 여러 종류의 클러스터링 바인딩을 포함한다. 세포 내 compartmen의 병렬, 초점 세포 외 유출에TS는 막 긴장의 방출에 기여하고, 큰 입자의 효과적인 식세포 작용에 중요하다. 액틴 중합 막 변형을 유도하는 신호 이벤트는 하나의 식세포 수용체를 유발 실험 모델에서 해부했다. FcRγ 쇄 매개 식균 작용하는 동안, 작은 GTP 아제 (RAC, Cdc42)에 의해 조절된다 강렬한 액틴의 중합이있다. 자신의 다운 스트림 이펙터 중, 비스 코트 – 올드리치 증후군 단백질 (WASP)은 액틴 필라멘트 1,2,4,10를 핵이 액틴 관련 단백질 복합체 2/3 (Arp2 / 3)의 활성화로 연결됩니다. 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P (2))의 로컬 생산 pseudopod 형성 초기 구동 액틴 중합 중요하다. PI (3,4,5) P (3) 그 변환은 pseudopod 확장 및 phagosome 폐쇄 (11)가 필요합니다. 여러 경로는 PI (4,5) P (2)의 실종에 기여한다. 포스파티딜 이노시톨 인산염 키나의 첫째 분리phagosome 체포의 PI (4,5) P (2) 합성에서 SES (PIPKIs). 둘째, 인산화 될 수 있고, 내가 키나제 (PI3K)를 PI3K 클래스에 의해 소비 PI (3,4,5) P (3) (12)에 변환됩니다. 포스와 포스 포에 대한 역할은 포유 동물 세포 및 Dictyostelium (13, 14)에 식균 작용 동안 PI (4,5) P (2) 가수 분해 및 F – 굴지 제거 암시하고있다. 포스 포 리파제 C (PLC) δ는 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 1,4,5- 트리스 포스페이트에 PI (4,5) P (2)를 가수 분해한다. 된 PI (4,5) P (2)와 PI (3,4,5) P (3) 인산 OCRL은 (로우의 로우 증후군)도 phagosome 형성에 관여하고있다. F – 굴지 및 해중합의 정확한 지역의 형성이 밀접하게 공간과 시간에 규제되고 우리가 세포 내 구획의 모집을 보인 것은 따라서 식세포 컵의 바닥에 지역 굴지의 해중합에 기여하고, 로컬 OCRL 포스 파타 아제를 제공하는 것이 중요하다 <sup> 13, 15. 이를 위해, 우리는 여기에 설명 된 실험 셋업을 사용 하였다.
phagosome 폐쇄 및 막 절단에 필요한기구 및 분자 선수는 가난 때문에 시각화 및 phagosome 폐쇄의 사이트를 모니터링의 어려움 정의 된 상태로 유지됩니다. 최근까지, 식균 작용은 어려운 phagosome 폐쇄의 사이트의 적시 시각화하고, 자신의 등쪽면에 또는면에 입자를 내면화 고정 또는 살아있는 세포에서 관찰되었다. 또한, 고정 방법은 세포막과 바이어스 pseudopodia 확장 및 폐쇄에 결과의 철회의 원인이 될 수 있습니다. 대조적으로, 우리가 설정하고 여기에 기술 한 분석은 우리가 pseudopod 확장 및 총 내부 반사 현미경 (TIRFM) (16)에 기초하여 살아있는 세포 (13)의 탐식의 폐쇄 단계를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 광학 투명의 계면에 얇은 영역에서 형광체를 여기하기 위해 소멸 파를 사용하므로뚜껑 (커버 슬립) 및 액체 (세포 배양 배지). 여진 깊이의 두께는 세포막에 가까운 분자 이벤트의 시각화를 허용 고체 표면에서 약 100 ㎚이다. TIRFM 높은 신호 대 바탕 비율을 허용 의한 세포의 조명에 수집 포커스 아웃 형광 세포 독성을 제한한다.
TIRFM을 활용, 우리는 커버 슬립이의 IgG-옵 소닌 적혈구 (IgG를-SRBCs)로 코팅 한 후 폴리 리신으로 활성화되는 "phagosome 폐쇄 분석"을 개발했다. 관심 일시적으로 찬란 태그 단백질을 발현하는 대 식세포는 다음의 IgG-SRBCs을 삼켜 할 수 있습니다. 세포 비공유 유리 표면에 바인딩 대상 입자를 분리하는 동안, pseudopods의 선단 관찰하고 TIRF 모드에서 기록 될 수있다. TIRF 인수는 마주 할 수있는 위의 3 단계 μm의를 이동 한 후, 표면 형광 모드에서 인수와 결합탐식 컵베이스의 ualization. 이러한 과정 액틴 또는 dynamin 억제 것과 약리학 약물의 첨가는 상기 분자 수준의 처리를 절개하는 것이 가능하다.
여기에 상세히 설명 된 프로토콜은 RAW264.7 쥐의 대식 세포주 및 옵 소닌 입자이지만, 사실상, 이것은 다른 포식 세포와 같은 비드와 같은 다른 표적에 적용될 수있다. 이 방법은 시간과 다양한 식세포 과정에서 pseudopod 확장 및 phagosome 폐쇄에 관여하는 분자 선수의 공간에서 규제의 더 나은 특성을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
