"Фагосоме Закрытие Анализ" для визуализации фагосоме Формирование в трех измерениях с помощью полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Фагоцитоз является одной из основных функций клеток, которая начинается с признания и связывание материала с поверхностными рецепторами, которые затем приводит к интернализации и деградации проглоченного материала. В то время как одноклеточные эукариоты , такие как пресс – формы Dictyostelium discoideum и амеб используют фагоцитоз для питания бактерий, высшие организмы эволюционировали с профессиональными клетками. Макрофаги или дендритные клетки являются первой линией защиты от патогенных микроорганизмов в различных тканях и органах, и имеют решающее значение для активации адаптивной иммунной системы посредством презентации антигена и продукции цитокинов 1-4. При определенных обстоятельствах фагоцитоз могут быть выполнены с помощью непрофессиональной фагоцитирующих клеток, например, эндотелиальных и эпителиальных клеток. Этот процесс имеет важное значение для поддержания гомеостаза в процессе развития и в зрелом возрасте для нормального оборота и ремоделировании ткани. И, наконец, специализированные фагоциты, такие как клетки Сертоли в яичках или сетчатки глазапигментные эпителиальные клетки являются чрезвычайно мощными фагоциты 5.
Формирование фагосому где деградация микроорганизмов или продуктов распада клеток происходит начинается с агрегацию фагоцитирующих рецепторов на поверхности фагоцитарной клетки. Передачи сигнала события после кластеризацию опсоническую рецепторов, таких как рецепторы Fc (FcR) и комплемент-рецепторов (CRS) были хорошо охарактеризованы. Тем не менее, есть также многочисленные не-опсоническую рецепторов, включая Toll-подобные рецепторы (TLR,), лектины, маннозы рецепторов и мусорщик рецепторов. Эти рецепторы распознают детерминанты на поверхности частицы , такие как манноза или остатков фукозы, фосфатидилсерин, и липополисахариды 1,6-9.
Возбудитель или остатков клеток распознавания включает в себя связывание с и группирование нескольких типов фагоцитарной-рецепторов, которые затем приводят к интенсивному и транзиторной актина ремоделирования. Параллельно фокальной экзоцитоза внутриклеточных compartmenТ.С. способствует освобождению мембранного натяжения и имеет важное значение для эффективного фагоцитоза крупных частиц. Сигнальные события, приводящие к актина полимеризации и деформации мембраны препарировали в экспериментальных моделях, которые спровоцировали одну фагоцитарную рецептор. Во время FCR-опосредованного фагоцитоза, происходит интенсивное полимеризация актина, которая регулируется малыми ГТФаз (Rac, Cdc42). Среди их вниз по течению эффекторов, синдром белок СВО (WASP) приводит к активации актин-родственного белка 2/3 комплекс (Arp2 / 3) , что зарождается актиновые филаменты 1,2,4,10. Местное производство фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфат (PI (4,5) P 2) имеет решающее значение для начальной полимеризации актина , который управляет псевдоподия образование. Его превращение в PI (3,4,5) P 3 требуется для псевдоподия расширения и закрытия фагосом 11. Несколько путей способствуют исчезновению PI (4,5) P 2. Во-первых отряд фосфатидилинозитол фосфатного кинаSES (PIPKIs) от PI фагосоме аресты (4,5) P 2 синтеза. Во- вторых, он может быть фосфорилируется и потребляемый класса I PI3K киназ (PI3K) и преобразуется в PI (3,4,5) P 3 12. Роль для фосфатаз и фосфолипаз также подразумевается в гидролизу PI (4,5) P 2 и F-актин удаления во время фагоцитоза в клетках млекопитающих и в Dictyostelium 13,14. Фосфолипазы С (PLC) δ гидролизует PI (4,5) P 2 в диацилглицерина и инозитол-1,4,5- трис- фосфата. PI (4,5) P 2 и PI (3,4,5) P 3 фосфатазы OCRL (окулоцереброренальный синдром Lowe) также участвует в формировании фагосом. Точная локальная формация F-актина и его деполимеризации жестко регулируется в пространстве и во времени, и мы показали, что набор внутриклеточных отсеков имеет важное значение для доставки локально фосфатазы OCRL, тем самым способствуя местным актина деполимеризации на базе фагоцитарной чаши <sup> 13,15. Для этого мы использовали описанный здесь Экспериментальная установка.
Механизм и молекулярные игроки, необходимые для закрытия фагосом и мембраны расщеплению остаются плохо определены из-за трудностей в визуализации и мониторинга сайта закрытия фагосом. До недавнего времени фагоцитоз не наблюдалось на фиксированных или живых клеток, которые позволяли частицы на их дорсальную лице или на их сторонах, что делает своевременную визуализацию места закрытия фагосом трудно. Кроме того, способы крепления может привести к втягиванию мембран и исказить результаты по расширению псевдоподий и закрытия. В противоположность этому , анализ , который мы создали и описать здесь позволяет визуализировать псевдоподия расширение и этап закрытия фагоцитоза в живых клетках 13, основанный на общей внутренней микроскопии отражения (TIRFM) 16. Этот оптический метод использует мимолетную волну для возбуждения флуорофоров в тонкой области на границе раздела между прозрачным таккрышка (покровное) и жидкость (культуральная среда клеток). Толщина глубины возбуждения составляет около 100 нм от твердой поверхности, что позволяет визуализировать молекулярных событий, близких к плазматической мембране. TIRFM позволяет высокое отношение сигнала к фону, и ограничивает флуоресценцию вне фокуса, собранной и цитотоксичность за счет освещения клеток.
Пользуясь TIRFM, мы разработали "фагосоме закрывающий анализа", в котором покровные активируются с поли-лизина и затем покрывают IgG-опсонированных красных кровяных телец (IgG-SRBCs). Макрофаги, экспрессирующие скоротечно флуоресцентно меченных белков, представляющих интерес, затем дают возможность поглотить IgG-SRBCs. В то время как клетки отделить целевые частицы, которые не являются ковалентно связаны с поверхностью стекла, можно наблюдать и записывается в режиме TIRF кончики подталкивателей. TIRF приобретения сочетаются с приобретения в режиме эпифлуоресцентной, после сдвига мкм стадия 3 выше, что позволяет Visualization основания фагоцитарной чаши. Добавление фармакологических препаратов, таких как те, ингибирование актина или динамин в ходе процесса также можно дополнительно рассекают процесс на молекулярном уровне.
Протокол, описанный подробно здесь для RAW264.7 мышиной линии клеток макрофага и опсонизированных частиц, но практически, она может быть адаптирована к любой другой фагоцитарной клетки и с другими целями, такие как шарики. Этот метод позволит лучше характеристику регулирования во времени и пространстве молекулярных игроков, участвующих в псевдоподия расширения и закрытия фагосом во время различных фагоцитирующих процессов.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
