"يبلوع إغلاق الفحص" لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
البلعمة هي وظيفة الخلايا الرئيسية التي تبدأ مع الاعتراف وربط المواد على السطح المستقبلات، مما يؤدي بعد ذلك إلى استيعاب وتدهور المواد بلعها. في حين حقيقيات النوى وحيدة الخلية مثل discoideum Dictyostelium العفن والاميبات استخدام البلعمة لتتغذى على البكتيريا، وقد تطورت الكائنات العليا مع خلايا المهنية. الضامة أو الخلايا الجذعية هي خط الدفاع الأول ضد الجراثيم في مختلف الأنسجة والأعضاء، وضرورية لتنشيط الجهاز المناعي التكيفي من خلال تقديم المستضد وخلوى إنتاج 1-4. في ظل ظروف معينة البلعمة يمكن أن يقوم بها الخلايا البلعمية غير المهنية، على سبيل المثال، البطانية والخلايا الظهارية. هذه العملية مهمة للحفاظ على التوازن خلال تطوير وفي مرحلة البلوغ لدوران الأنسجة الطبيعية والتجديد. البالعات أخيرا، متخصصة مثل خلايا سيرتولي في الخصية أو شبكية العينالخلايا الظهارية الصباغ للغاية البالعات قوية 5.
تشكيل يبلوع حيث يحدث تدهور الكائنات الدقيقة أو الحطام الخلوي يبدأ مع تجميع مستقبلات البلعمية على سطح الخلية البلعمية. الأحداث يشير إلى المصب التالية تجميع مستقبلات طهائية مثل مستقبلات التيسير (FCR) أو تكمل مستقبلات (CRS) اتسمت بشكل جيد. ومع ذلك، هناك أيضا العديد من مستقبلات غير طهائية بما في ذلك مستقبلات تول مثل (TLRs)، يكتينس، مستقبلات المانوز ومستقبلات زبال. هذه المستقبلات تعترف المحددات على سطح الجسيمات مثل المانوز أو فوكوسي المخلفات، فسفاتيديل، وعديدات سكر شحمية 1،6-9.
ويشمل الممرض أو الحطام الخلية الاعتراف ملزم لوتجميع عدة أنواع من مستقبلات البلعمية، التي تؤدي بدورها إلى المكثف وعابرة إعادة الأكتين. بالتوازي إيماس البؤري، من المقصوره داخل الخلايانهاية الخبر تساهم في الافراج عن التوتر الغشاء والمهم بالنسبة البلعمة فعالة من الجزيئات الكبيرة. تم تشريح الأحداث يشير مما يؤدي إلى الأكتين البلمرة وغشاء تشوه في النماذج التجريبية التي ادت الى مستقبلات أكلة واحدة. خلال البلعمة بوساطة FCR، هناك مكثفة بلمرة الأكتين التي ينظمها GTPases صغيرة (راك، Cdc42). بين المؤثرات الخاصة المصب، والبروتين متلازمة ويسكوت الدريخ (WASP) يؤدي إلى تفعيل للذات أكتين البروتين 2/3 مجمع (Arp2 / 3) أن nucleates خيوط الأكتين 1،2،4،10. الإنتاج المحلي لل، 5 bisphosphate (PI (4،5) ف 2) فوسفتيدلينوستول-4 هو أمر حاسم لبلمرة الأكتين الأولية أن يدفع تشكيل pseudopod. مطلوب تحولها إلى PI (3،4،5) ف 3 لتمديد pseudopod وإغلاق يبلوع 11. وتساهم عدة مسارات لاختفاء PI (4،5) ف 2. أولا مفرزة من فوسفتيدلينوستول الفوسفات الكيناإس إي إس (PIPKIs) من PI الاعتقالات يبلوع (4،5) ف 2 التوليف. ثانيا، يمكن فسفرته والتي يستهلكها الصف الأول PI3K تحركات (PI3K) وتحويلها في PI (3،4،5) ف 3 12. كما تم ضمنية دور للفوسفاتاز وفوسفوليباز في PI (4،5) ف 2 التحلل وإزالة F-أكتين خلال البلعمة في خلايا الثدييات وفي Dictyostelium 13،14. وδ فسفوليباز C (PLC) hydrolyzes PI (4،5) ف 2 في مادة ال diacylglycerol وإينوزيتول 1،4،5- تريس الفوسفات. كما تم تورط PI (4،5) ف 2 و PI (3،4،5) ف 3 الفوسفاتيز OCRL (متلازمة عينية مخية كلوية من لوي) في تشكيل يبلوع. تشكيل المحلية الدقيق للF-الأكتين والتحلل لها وينظم بإحكام في المكان والزمان، ونحن قد أظهرت أن التوظيف من المقصورات داخل الخلايا المهم لتقديم محليا الفوسفاتيز OCRL، مما يسهم في التحلل الأكتين المحلي في قاعدة الكأس أكلة <sup> 13،15. لهذا، كنا مجموعة تصل التجريبي هو موضح هنا.
تبقى آلية والجزيئي اللاعبين المطلوب للإغلاق يبلوع وانفصال الغشاء محددة بشكل واضح بسبب الصعوبات في تصور ورصد موقع إغلاق يبلوع. حتى وقت قريب، وقد لوحظ البلعمة على خلايا ثابتة أو الحية التي استيعاب جزيئات على وجهه الظهرية أو على الجانبين، مما يجعل من التصور في الوقت المناسب من موقع يبلوع إغلاق الصعب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن طرق تحديد يسبب انكماش الأغشية والتحيز النتائج على تمديد أقدام كاذبة والإغلاق. على النقيض من ذلك، وفحص أن أنشأنا ووصف هنا يسمح لنا تصور تمديد pseudopod وخطوة إغلاق البلعمة في الخلايا الحية 13، على أساس إجمالي المجهر التأمل الداخلي (TIRFM) 16. تستخدم هذه التقنية البصرية موجة زائل لإثارة fluorophores في منطقة رقيقة في واجهة بين شفافية حتىغطاء (ساترة) وسائل (مستنبت الخلية). سمك عمق الإثارة حوالي 100 نانومتر من سطح صلب، مما يسمح التصور من الأحداث الجزيئية قريبة من غشاء البلازما. TIRFM يسمح ارتفاع نسبة إشارة إلى الخلفية، ويحد من مضان خارج نطاق التركيز جمعها والسمية الخلوية بسبب الإضاءة من الخلايا.
الاستفادة من TIRFM، قمنا بتطوير "يبلوع إغلاق فحص" التي يتم تنشيط coverslips مع بولي يسين ثم المغلفة مع خلايا الدم الحمراء opsonized مفتش (مفتش-SRBCs). ثم يسمح الضامة معربا عن البروتينات عابر الموسومة fluorescently التي تهم تبتلع مفتش-SRBCs. في حين أن الخلايا فصل الجزيئات المستهدفة التي هي ملزمة لسطح الزجاج غير تساهمي، نصائح من pseudopods يمكن ملاحظتها وتسجيلها في وضع TIRF. يتم الجمع بين الاستحواذ TIRF مع الاستحواذ في وضع epifluorescence، بعد تحويل ميكرون المرحلة 3 أعلاه، والذي يسمح فيماualization من قاعدة الكأس البلعمة. إضافة العقاقير الدوائية مثل تلك التي تحول دون الأكتين أو dynamin أثناء عملية ممكنة أيضا لزيادة تشريح عملية على المستوى الجزيئي.
بروتوكول صفها بالتفصيل هنا هو لالفئران خط خلية بلعم RAW264.7 والجسيمات opsonized، ولكن عمليا، ويمكن أن تتكيف مع أي خلية أكلة أخرى ومع أهداف أخرى مثل الخرز. وهذه الطريقة تسمح توصيف أفضل للتنظيم في الزمان والمكان من اللاعبين الجزيئية تشارك في تمديد pseudopod وإغلاق يبلوع خلال مختلف العمليات أكلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
