Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
Die Säuger Herz ist ein großer Verbraucher von ATP und erfordert eine ständige Energiezufuhr für Substrate Kontraktion. Es überrascht nicht, Veränderungen der myokardialen Stoffwechsel wurden zur Entwicklung der Kontraktions Dysfunktion und Herzinsuffizienz verknüpft. Daher sollte auf einige der Mechanismen beleuchten den Zusammenhang zwischen Stoffwechsel und Kontraktion entwirren Herz Anpassung oder Fehlanpassung bei Krankheitszuständen regeln. Die isolierte Rattenherz arbeitet Zubereitung kann folgen verwendet werden, gleichzeitig und in Echtzeit, Herzkontraktionsfunktion und Energiefluß Substrate in oxidativen Stoffwechselwege bereitstellt. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Puffern für die quantitative Messung der Geschwindigkeiten der Oxidations für Glukose und Fettsäuren zur Verfügung zu stellen, der Hauptenergiesubstrate des Herzens bereitstellt. Die Verfahren zur Probenanalyse und Dateninterpretation verwendet werden ebenfalls diskutiert.Kurz gesagt, ist die Technik , die auf die Lieferung von 14 C- radiomarkierten Glucose und einem 3 H radioaktiv markierten Fettsäure langkettige zu einem ex vivo schlagendes Herz über normothermic kristalloider Perfusion. 14 CO 2 und 3 H 2 O, Ende Nebenprodukte die enzymatischen Reaktionen in der Nutzung dieser Energie liefert Substrate beteiligt sind, werden dann quantitativ aus dem koronaren Ausflusses gewonnen. Bei Kenntnis der spezifischen Aktivität der radiomarkierten Substraten verwendet wird, ist es dann möglich, individuell auf den Fluss von Glukose und Fettsäure in der Oxidationswege quantifizieren. Kontraktionsfunktion des isolierten Herz kann mit dem entsprechenden Aufnahmegeräte und direkt korreliert metabolischen Flusswerte parallel bestimmt werden. Die Technik ist sehr nützlich, um den Stoffwechsel / Kontraktionsverhältnis in Antwort auf verschiedene Stressbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in pre und nach der Belastung und Ischämie zu untersuchen, ein Medikament oder ein circulating Faktor oder Produkt nach der Veränderung der Expression eines Gens.
Introduction
Klinische Relevanz
Im Säugerherz, gibt es eine starke positive Beziehung zwischen dem Fluß von Substraten durch oxidativen Stoffwechselwege, ATP Erzeugungs- und Herzarbeit 1. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich die Untersuchung der komplizierten Verbindung zwischen Herz-Stoffwechsel und Funktion führte zu erkennen , dass Veränderungen in der Herzstoffwechsel eine Ursache für die Kontraktions Dysfunktion sind und möglicherweise pathologischen strukturellen Umbau bei der Festlegung der verschiedenen Arten von Herzerkrankungen 2-4. daher wird erwartet , dass unser Verständnis der Mechanismen metabolischen Umbau des belasteten Herzleitungs wird zur Vorbeugung oder Behandlung von Herzinsuffizienz 5-7 zur Identifizierung therapeutischer Targets führen. Die jüngste Veröffentlichung einer wissenschaftlichen Erklärung der American Heart Association zum Thema "Beurteilung der Herz Metabolism", betont das wachsende Interesse der wissenschaftlichen Gemeinschaft für tsein Forschungsgebiet 8. Doch während die technologischen Fortschritte in der Herzbildgebung jetzt für eine schnelle und genaue Bewertung der kardialen Morphologie und Funktion zu ermöglichen, die in – vivo – Studie von Herz-Stoffwechsel bleibt begrenzt und beschwerlich: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spektroskopie und Positronen – Emissions – Tomographie (PET) Bildgebung kann werden verwendet , um Herzenergiereichen Phosphatstoffwechsel und Krebs – Zyklus – Aktivität, aber diese Techniken sind geplagt durch hohe Betriebskosten und durch ihre Unfähigkeit zur Bestimmung des Beitrags der verschiedenen Substrate zu oxidativen Stoffwechsel in stationären Bedingungen 9 .To diesem Zeitpunkt der ex vivo verfolgen Herz Vorbereitung Arbeits stellt die einzige und einzigartige Technik zur Verfügung, gleichzeitig zu studieren und in Echtzeit, Kontraktionsfunktion und Fluss von Substraten in oxidativen Stoffwechselwege 7,9. Das folgende Protokoll zielt darauf ab, Richtlinien für die Herstellung und Verwendung von Reagenzien zu schaffen, verwendet die Ratte zu bestimmen,es von Substraten Nutzung in der isolierten Arbeitsrattenherz.
Die isolierte Arbeits Nagetier-Herz-Apparat
Obwohl die Technik Hälfte ist fast ein Jahrhundert alt, bleibt die isolierte Arbeitsrattenherz Vorbereitung eine Methode der Wahl für Herz-Kreislauf-Forschung. Wie bei der Langendorff-Herz der Zubereitung bietet das Arbeits rodent Herz eine relativ einfache, zuverlässige und kostengünstige Möglichkeit, eine Vielzahl von Herzparameter unabhängig von den verwirrenden Effekte anderer Organe, neurohormonal und andere zirkulierende Faktoren zu messen. Aber im Gegensatz zu dem Langendorff perfundierten Herzen, das Arbeits Herz weiterhin nahezu physiologischen Herzarbeit, eine Voraussetzung für die Bildung von oxidativen metabolischen Flusses auf ein Niveau durchzuführen , die zu in vivo – Bedingungen relevant sind. Dies wird durch die Bereitstellung der Perfusionspuffer mit dem linken Ventrikel (LV) über eine Kanüle mit dem linken Vorhof erreicht, und da der LV füllt und Verträge, diePuffer wird durch die Aorten-Leitung gegen einen entschlossenen Nachbelastung hydrostatischem Druck ausgestoßen. Das Design der Perfusionsapparatur beschrieben ursprünglich von Neely und Kollegen 10 wurde anschließend durch Taegtmeyer verbessert, Säume und Krebs 11, hat aber nur sehr wenig verändert seitdem. Wie in der ursprünglichen Gerät beschrieben, kann Kontraktionsfunktion durch Bestimmung der Herzleistung beurteilt werden, nicht mehr als Messzylinder mit und eine Stoppuhr Aorten zu messen und koronare fließt 10,11. Mehrere Hersteller bieten nun komplette Arbeits Nagetier Herz Perfusionssystemen. Diese kommerziell erhältlichen Vorrichtung kann mit flowprobes, Druckwandler erfaßt werden, ein Druck-Volumen-Katheter und die gesamte Ausrüstung, die für Herzfunktionsdatenerfassung und -analyse. Die Hersteller bieten eine umfangreiche Dokumentation und Schulungen den neuen Benutzer mit ihrer Ausrüstung vertraut zu machen. Einige Übersichten auch Detail-Protokolle auf dem Arbeits Herz instrumentation und über die Verwendung von Kathetern , Herzfunktion in Nagetieren 12-15 zu messen. Aus diesem Grund werden wir nur kurz auf die Set-up des Perfusionsgerät erwähnen und dem Aufnahmegerät. Das vorliegende Protokoll vielmehr soll die bereits vorhandenen Informationen mit einer Beschreibung der Methoden zu ergänzen, die gleichzeitig durchgeführt werden können, um die Raten der Glukose und langkettigen Fettsäureoxidation, die beiden großen Energie liefert Substrate in der normalen Herz messen. Wir beschreiben hier all die Schritte bei der Verwendung von radiomarkiertem Energiesubstrate für die Beurteilung der myokardialen oxidativen Metabolismus, aus der Herstellung von Reagenzien und Puffer zur Gewinnung und Verarbeitung von Proben, zur Datenanalyse.
Prinzipien des Verfahrens
Kardiomyozyten erzeugen den größten Teil ihrer Energie für die Kontraktion von der oxidative Phosphorylierung von Fettsäuren (hauptsächlich langkettige Fettsäuren) und Kohlenhydrate (glucose und Laktat). Das Herz hat eine begrenzte sehr energisch Reserven und stützt sich auf eine ständige Zufuhr dieser Energie liefert Substrate aus dem Kreislauf. Der Katabolismus von Glucose durch den glykolytischen Weg ergibt Pyruvat, das dann durch die Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex von der inneren Mitochondrienmembran decarboxyliert wird. Langkettige Fettsäuren, extrahiert aus Triglyceriden Albumin oder Lipoprotein Zirkulieren werden zuerst in Acyl-CoA-Molekülen in das Cytosol aktiviert und anschließend in der mitochondrialen Matrix durch die Carnitin-Shuttle transportiert, um die beta-Oxidationswegs ein. Die Acetyl-CoA – Molekülen durch den Katabolismus von Glucose und Fettsäuren , die den Krebs – Zyklus Kraftstoff die Reduktionsäquivalente (NADH und FADH 2) , die durch die Elektronentransportkette , verwendet werden zur Erzeugung der Protonen-Antriebskraft über die innere Mitochondrienmembran zu bauen und ATP durch die Aktivität der ATP-Synthase erzeugen. Wasser und Kohlendioxid sind die End-Nebenproduktedie enzymatischen Reaktionen im Inneren des Krebs-Zyklus stattfindet. Die Lieferung von 14 C- und H- 3 radiomarkierte Substrate (wie beispielsweise 14 C-radioaktiv markiertem Glukose und 3 H-radiomarkierten Ölsäure) zum isolierten Arbeits Herz wird folglich für die Produktion von 14 CO 2 und 3 H 2 O führen, wo quantitativ aus dem koronaren Abwasser zurückgewonnen werden. Die Sammlung von 14 CO 2 wird durch Halten der isoliert perfundierten Herzen in eine abgedichtete Kammer und durch sofortiges Gewinnen des koronaren Abflusses durchgeführt , wie es das Herz verlässt. Eine kleine Anionenaustauschsäule verwendet 3 H 2 O aus dem koronaren Ausfluß zu trennen und zu gewinnen. Die Radioaktivität aus den verarbeiteten Proben wird mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen und mit Kenntnis der spezifischen Aktivität der radiomarkierten Substraten verwendet, ist es dann möglich, den Fluss von Glukose und Fettsäure in der individuell QuantifizierenOxidationswege 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der vorstehende Protokoll beschreibt die Methoden, um gleichzeitig den Fluss des Substrats durch Glucose-Oxidation und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherzen zu quantifizieren. Die Messungen können dann auf die aufgezeichneten Herzfunktionsparameter überlagert werden , um die Beziehung zwischen den Substraten Stoffwechsel und Herzarbeit unter der Basislinie und Belastungsbedingungen (Veränderung der Arbeitsbelastung, Ischämie-Reperfusion, etc …) zu bestimmen. Es ist auch mögl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
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