격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
포유류 마음은 ATP의 주요 소비자이며, 수축의 에너지 기판의 지속적인 공급이 필요합니다. 당연히 심근 대사의 변화가 수축 부전 심부전의 개발과 연결되어있다. 따라서, 신진 대사 및 수축 사이의 링크를 푸는 것은 질병 상태에서 심장 적응 또는 부적응을 지배하는 메커니즘의 일부에 빛을 흘렸다한다. 분리 된 래트 심장 작동 준비를 동시에 실시간 심장 수축 기능 및 산화 적 대사 경로에 기판을 제공하는 에너지의 흐름에 따라 사용될 수있다. 본 프로토콜은 포도당 지방산, 심장의 기판을 제공하는 주된 에너지 산화 비율의 정량적 측정을 위해 버퍼의 제조 및 이용에 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공하는 것을 목적으로한다. 시료 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법에 대해서도 설명합니다.간단히 말해서,이 기술은 정상 체온 결정질 관류 통해 생체 심장 박동로 (14)의 공급 C- 방사성 포도당과 3 H- 방사성 장쇄 지방산에 기초한다. 14 CO 2, 3 H 2 O, 최종 부산물 이러한 에너지 제공 기판의 사용에 관여하는 효소 반응은 다음 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회수된다. 사용되는 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 산화 경로에 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다. 분리 된 심장의 수축 기능은 해당 기록 장치와 병렬로 결정될 직접 대사 플럭스 값과 상관 될 수있다. 이 기술은 사전에로드 및 국소 빈혈, 약물 또는 circula 후 변경 등 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 대사 / 수축 관계를 연구하는 것이 매우 유용하다유전자 산물의 발현의 변화 다음 팅 계수 나.
Introduction
임상 관련성
포유 동물의 심장에서 산화 적 대사 경로, ATP 생성과 심장 작품 (1)을 통해 기판의 플럭스 사이에 강한 긍정적 인 관계가있다. 지난 20 년 동안 심장 대사와 기능 사이의 복잡한 링크의 조사는 심장 대사의 변화는 심장 질환 2-4의 다른 유형의 설정에서 수축 기능 장애 가능성이 병리학 적 구조 리모델링에 대한 원인을 인식하게되었다. 따라서, 스트레인 된 심장의 대사 리모델링을 관리하는 메커니즘에 대한 이해 심부전 5-7의 예방 또는 치료를위한 치료 표적의 확인을 초래할 것으로 예상된다. "심장 대사의 평가"에 미국 심장 협회에서 과학적 진술의 최근 간행물은 t에 대한 과학계의 관심이 점점 강조연구 (8) 자신의 분야. 심장 이미징 기술의 진보는 이제 심장 형태와 기능의 신속하고 정확한 평가를 허용 반면, 심장 대사의 생체 내 연구는 제한적이고 부담이 남아있다 : 핵 자기 공명 (NMR) 분광법과 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상 수 생체 외 날짜 .TO 정상 상태 조건에서 산화 대사에 대한 다양한 기판 기여 9 판별 심장 고 에너지 인산 대사 크렙스 회로 활동을 수행하는데 사용될 수 있지만, 이러한 기술들은 높은 운영 비용으로 자신의 무능력 퍼진 마음의 준비 작업을 동시에 실시간으로, 산화 적 대사 경로 7,9에 수축 기능과 기판의 플럭스에서 공부하는 유일하고 독특한 기술을 사용할 나타냅니다. 다음 프로토콜 래트를 결정하는데 사용될 시약의 제조 및 이용의 지침을 제공하는 것이다격리 된 작업 쥐의 심장에 기판 활용 말이지.
격리 된 작업 쥐 심장 장치
기술은 반세기 이전이지만, 분리 작업 쥐 심장 제제는 심혈관 연구를 선택하는 방법을 남아있다. 랑겐 돌프 심장 제조와 마찬가지로 작용 쥐 심장 신경 호르몬 다른 장기와 다른 순환 계수의 교란 효과는 독립적으로 심장의 다양한 파라미터를 측정 할 수있는 비교적 간단한 신뢰성 있고 저렴한 방법을 제공한다. 그러나 랑겐 돌프 – 관류 마음 대조적으로, 작업 심장에 가까운 생리 심장 연구, 생체 조건에 관련이있는 수준으로 산화 대사 플럭스의 생성을위한 전제 조건을 수행하고 있습니다. 이것은 좌심방 접속 캐뉼라를 통해 좌심실 (LV)로 관류 버퍼를 제공함으로써 달성되고 LV는 채우고 계약으로되어버퍼가 결정된 후 부하 수압에 대한 대동맥 라인을 통해 배출됩니다. 원래 10 이후 Taegtmeyer, HEMS와 크렙스 (11)에 의해 개선 되었으나 닐리와 동료에 의해 기술 된 관류 장치의 디자인은 이후 약간 변경되었습니다. 원래 장치에서 설명한 바와 같이, 수축 기능은 대동맥 측정하기 위해 더 이상 메스 실린더 및 스톱워치를 사용하지 않고, 심 박출량의 측정을 통해 평가 될 수 있고, 관상 동맥은 10, 11을 흐른다. 여러 벤더가 완료 작업 쥐 심장 관류 시스템을 제공합니다. 이들 시판되는 장치 flowprobes, 압력 센서, 압력 볼륨 카테터와 심장 기능의 데이터 수집과 분석에 필요한 모든 장비를 얻을 수있다. 공급 업체는 장비와 새로운 사용자 익숙해 광범위한 문서 및 교육 세션을 제공합니다. 작업 심장기구도에 여러 또한 리뷰 기사 상세 프로토콜[슬라이드 쇼와 카테터의 사용에 설치류 12-15에서 심장 기능을 측정합니다. 이러한 이유로, 우리는 잠시 관류 장치 및 기록 장치의 설정을 언급한다. 본 프로토콜은 다소 동시에 포도당과 장쇄 지방산 산화의 속도는 정상적인 심장의 두 가지 에너지를 제공하는 기판을 측정하도록 구현 될 수있는 방법에 대한 설명과 함께 이미 이용 가능한 정보를 보완하는 것이다. 우리는 데이터 분석 샘플의 회수 및 처리 시약 및 버퍼의 제조에서, 심근 산화 대사 평가 방사성 에너지 기판의 사용에 관련된 현재의 모든 단계를 설명한다.
이 방법의 원리
심근 (glucos를 지방산 (주로 장쇄 지방산)과 탄수화물의 산화 적 인산화의 수축 에너지의 대부분을 생성전자 및 락 테이트). 심장은 매우 정력 보유 제한 및 순환에서 이러한 에너지 제공 기판의 지속적인 공급에 의존하고있다. 당분 경로를 통한 글루코오스의 이화는 미토콘드리아 내막의 피루 베이트 탈수소 효소 복합체에 의해 탈 카복실 화되는 피루브산을 산출한다. 알부민 또는 지단백질 순환하는 트리글리세리드에서 추출한 장쇄 지방산은 제 세포질에서 아실 CoA를 분자로 활성화되고,이어서 베타 산화 경로를 입력 카르니틴 셔틀 통하여 미토콘드리아 기질 내부에 반송된다. 포도당 지방산의 분해 작용에 의해 생성 된 아세틸 -CoA 분자 미토콘드리아 내막을 가로 질러 양성자 원동력을 구축하는 전자 전달계에 사용되는 환원 등가물 (NADH와 FADH 2)를 생성하는 크렙스 회로 연료 및 ATP에 합성 효소의 활동을 통해 ATP를 생성합니다. 물과 이산화탄소의 단부 부산물이다크렙스 사이클 내에서 일어나는 효소 반응. 14 C- 3 H- 방사성 표지 된 기질의 공급은 절연 작업 심장 (예 : C-14 방사성 표지 된 글루코스, 3 H-방사성 올레산) 따라서 14 CO 2, 3 H 2 O의 생산을 유도 할 수있다 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회복 될 수있다. 14 CO 2의 컬렉션은 밀폐 챔버에 격리 관류 심장을 유지하여 그것을 중심을 빠져 나올 때 바로 관상 동맥 유출 물을 회수하여 실시된다. 작은 음이온 교환 컬럼 분리하여 관상 동맥 유출 물로부터 3 H 2 O를 복구하기 위해 사용된다. 처리 된 샘플의 방사능을 액체 섬광 계수기로 측정 한 결과, 사용 된 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다산화는 16, 17을 경로.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜을 동시에 분리 작업 쥐 심장 글루코스 산화 및 지방산 산화를 통해 기판의 광속을 정량화하는 방법을 자세히. 측정은 (… 등의 부하 변화, 허혈 재관류) 기준선 스트레스 조건 하에서 기판 대사 심장 워크 간의 관계를 결정하기 위해 기록 된 심장 기능 파라미터에 중첩 될 수있다. 이는 대사 / 수축 관계 심부전 및 당뇨병과 같은 기존의 상태에 의해 영향을받는 방법을 평가하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
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