La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione
Summary
Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.
Abstract
registrazioni elettrofisiologiche da fette del midollo spinale hanno dimostrato di essere una tecnica preziosa per indagare su una vasta gamma di questioni, dal cellulare alla proprietà della rete. Mostriamo come preparare fette oblique vitali del midollo spinale di topi giovani (P2 – P11). In questa preparazione, i motoneuroni mantengono le loro assoni che esce dalle radici ventrali del midollo spinale. La stimolazione di questi assoni suscita back-propaganti potenziali d'azione che invadono il somas motoneurone ed eccitanti collaterali del motoneurone nel midollo spinale. La registrazione dei potenziali d'azione antidromic è un modo immediato, definitivo ed elegante per caratterizzare l'identità del motoneurone, che supera gli altri metodi di identificazione. Inoltre, stimolando le collaterali motoneurone è un modo semplice e affidabile per eccitare i bersagli collaterali dei motoneuroni nel midollo spinale, come altri motoneuroni o Renshaw cellule. In questo protocollo, vi presentiamo le registrazioni antidromic dal motoneurone somas così come l'eccitazione delle cellule Renshaw, derivante dalla stimolazione della radice ventrale.
Introduction
Storicamente, le registrazioni del motoneurone utilizzando sharp-elettrodi sono stati condotti in vivo su animali di grossa taglia come gatti o topi 1 o su un isolato intero midollo spinale nei topi 2. L'emergere della tecnica di registrazione patch-clamp nel corso del 1980, chiamato per l'accesso diretto al motoneurone somas come guarnizioni doveva essere raggiunto sotto la guida visiva. Così, il midollo spinale preparazione fetta è stato raggiunto facilmente a partire dai primi anni 1990 3. Tuttavia, la preparazione fetta precoce spesso non consentiva la stimolazione delle radici ventrali. Per quanto a nostra conoscenza, solo due studi hanno riportato la stimolazione successo delle radici ventrali a fette trasversali, e nessuno è stato ottenuto da topi 4,5.
In questo articolo presentiamo una tecnica per ottenere valide fette del midollo spinale di topi neonati (P2 – P11) in cui la piscina motoneuroni conserva le sue radici ventrali partenza assoni. Sfogola stimolazione della radice ral innesca potenziale d'azione antidromic di nuovo nelle somas della piscina motoneuroni in uscita dalla stessa radice ventrale. Si eccita anche gli obiettivi collaterali motoneurone, altri motoneuroni 6-10 e le cellule Renshaw 11-13. Dal momento che solo motoneuroni inviano i loro assoni le radici ventrali, usiamo la registrazione dei potenziali d'azione antidromic come un modo semplice e definitivo per physiologicaly identificare motoneuroni 10.
Oltre a utilizzare criteri elettrofisiologici e morfologici potenzialmente non inclusivi o fuorvianti per confermare l'identità del motoneurone, recenti studi sui motoneuroni del midollo spinale anche invocato noioso e che richiede tempo post hoc colorazioni 16. Tale identificazione viene solitamente eseguita solo su un campione delle cellule registrate. Altre strategie di identificazione basano su linee di topi in cui i motoneuroni esprimono fluorescenza endogena <sup> 17-19. Tuttavia, utilizzando i marcatori geneticamente codificate può essere difficile in giovane età, quando l'espressione marcatore è ancora variabile o se lo studio richiede già utilizzando una linea di topi transgenici. In alternativa, azione antidromic potenziali registrazioni possono essere effettuate sistematicamente su tutti i topi dall'insorgenza della registrazione cellule. Gli sperimentatori che lavorano su intatti i preparativi del midollo spinale nel gatto, ratto e nel topo, hanno usato in modo affidabile queste tecniche di identificazione dal 1950 1,2,20,21. In condizioni ottimali, siamo stati in grado di suscitare potenziali d'azione antidromic praticamente da tutti i motoneuroni registrati.
Inoltre, la stimolazione della radice ventrale può essere utilizzata per eccitare affidabile altre motoneuroni 22,23 o loro bersagli. le cellule Renshaw 10,24,25. Vi presentiamo qui le applicazioni della stimolazione della radice ventrale, sotto forma di azione antidromic potenziali registrazioni dal motoneurone somas, così come l'eccitazione delle cellule Renshaw.
Protocol
Representative Results
Discussion
affettare obliqua del midollo spinale è importante in quanto consente per la stimolazione unilaterale delle piscine del motoneurone e cellule Renshaw in un unico segmento vertebrale in modo affidabile, completa e specifica. Inoltre, consente una rapida identificazione, elegante e non ambigua dei motoneuroni registrati. Successivamente, si metterà in evidenza i vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di preparazione fetta, e poi ci sottolineare le insidie più comuni da evitare durante l'esecuzion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer per il loro aiuto nel prendere le fotografie. Gli autori ringraziano anche Arjun Masukar e Tobias Bock per la correzione del manoscritto. sostegni finanziari sono stati forniti dalla Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), il NIH-NINDS (R01NS077863), il Thierry Latran Foundation (OHEX Project), l'associazione francese per la miopatia ( concessione numero 16026) e target SLA sono ringrazia. Felix Leroy è stato il destinatario di un "Contratto di Dottorato" presso l'Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
References
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