A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral
Summary
Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.
Abstract
gravações electrofisiológicos a partir de fatias de medula espinal têm provado ser uma técnica valiosa para investigar um grande número de questões, a partir de propriedades da rede celular. Mostramos como preparar fatias oblíquas viáveis da medula espinhal de ratos jovens (P2 – 11). Nesta preparação, os motoneurónios reter os seus axónios que sai das raízes ventrais da medula espinal. A estimulação desses axônios provoca back-propagação potenciais de ação que invadem o somas motoneurônio e emocionantes garantias do motoneurônios na medula espinhal. Gravação de potenciais de ação antidrômicos é uma forma imediata, definitiva e elegante para caracterizar a identidade motoneurônio, que supera outros métodos de identificação. Além disso, estimular as garantias de neurónios motores é uma maneira simples e confiável para excitar os alvos colaterais dos neurónios motores na medula espinhal, como outros neurónios motores ou Renshaw células. Neste protocolo, apresentamos gravações antidrômicos do motoneurônio somas, bem como excitação celular Renshaw, resultante da estimulação da raiz ventral.
Introduction
Historicamente, as gravações de neurónios motores que utilizam afiado-eléctrodo foram realizadas in vivo em animais de grande porte, tais como gatos ou ratos 1, ou por um conjunto isolado da medula espinal em ratos 2. O surgimento da técnica de gravação de patch-clamp durante os anos 1980, chamado para o acesso directo à motoneurônio somas como a selagem necessária para ser alcançado sob a orientação visual. Assim, a preparação fatia da medula espinal foi prontamente alcançado desde o início da década de 1990 3. No entanto, a preparação fatia precoce muitas vezes não permitir a estimulação das raízes ventrais. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas dois estudos relataram a estimulação bem sucedida das raízes ventrais em fatias transversais, e nenhuma foi obtido a partir de camundongos 4,5.
Neste artigo apresentamos uma técnica para alcançar fatias de medula espinhal viáveis de ratos neonatal (P2 – P11) em que o agregado neuromotor mantém suas raízes partida axônios ventral. respiradouroestimulação da raiz ral desencadeia potencial de ação antidrômica de volta para as somas do agregado neuromotor sair da mesma raiz ventral. Ele também excita os objectivos de garantia de neurónios motores, outros motoneurônios 6-10 e as células de Renshaw 11-13. Uma vez que apenas neurónios motores enviam seus axônios para baixo as raízes ventrais, usamos o registro de potenciais de ação antidrômicos como uma maneira simples e definitiva para fisiologicamente identificar neurónios motores 10.
Além de usar critérios eletrofisiológicos e morfológicos potencialmente não incluído ou enganosas para confirmar a identidade motoneurônio, estudos recentes sobre neurónios motores da medula espinhal também contou com tediosa e demorada post hoc colorações 16. Esta identificação é normalmente realizado apenas numa amostra das células gravadas. Outras estratégias de identificação dependem de linhas de rato em que os neurónios motores expressar fluorescência endógena <sup> 17-19. No entanto, usando marcadores codificados geneticamente pode ser difícil em uma idade jovem, quando a expressão do marcador ainda é variável ou se o estudo já requer o uso de uma linha de rato transgénico. Alternativamente, as gravações de potenciais de acção antidrômica pode ser realizado rotineiramente em todos os ratinhos a partir do início da gravação célula. Experimentadores de trabalho sobre os preparativos da medula espinhal intactas no gato, rato e rato, têm utilizado de forma confiável tais técnicas de identificação desde 1950, 1,2,20,21. Em condições óptimas, fomos capazes de desencadear potenciais de acção antidrômicos a partir de praticamente todos os neurónios motores gravados.
Além disso, a estimulação raiz ventral pode ser usado com fiabilidade para excitar outros motoneurónios 22,23 ou os seus alvos. as células de Renshaw 10,24,25. Apresentamos aqui as aplicações da estimulação raiz ventral na forma de ação antidrômica potenciais gravações de somas motoneurônio, bem como excitação de células de Renshaw.
Protocol
Representative Results
Discussion
corte oblíquo da medula espinhal é importante uma vez que permite a estimulação unilateral de piscinas de neurónios motores e células de Renshaw em um único segmento vertebral de uma forma fiável, completo e específico. Além disso, ele permite uma identificação rápida, elegante e não-ambígua de neurónios motores gravados. Em seguida, vamos destacar as vantagens desta técnica em comparação com outros métodos de preparação fatia, e depois vamos forçar para fora das armadilhas mais comuns para evitar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer por sua ajuda em tomar as fotografias. Os autores agradecem também Arjun Masukar e Tobias Bock pela revisão do manuscrito. apoios financeiros foram fornecidos pela Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), o NIH-NINDS (R01NS077863), a Fundação Latran Thierry (OHEX Projeto), a associação francesa para miopatia ( número de concessão 16026) e Target ALS é reconhecido agradecimento. Felix Leroy foi o destinatário de um "Contrato de Doutorado" da Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
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