リンパ腺や血球中を調べるための方法<em>ショウジョウバエ</em>幼虫
Summary
ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系は、 ショウジョウバエの造血を研究するための魅力的な遺伝モデル作り、多くの共通の特徴を共有します。ここでは、免疫組織化学のための主要な幼虫の造血器官の解剖と取り付けを示しています。また、循環血球と固着液晶セルを含む様々な幼虫の造血コンパートメントをアッセイする方法を記載しています。
Abstract
多くの類似点は、 ショウジョウバエ、哺乳動物の適応免疫を特徴付けるリンパ系統を欠いていても、 ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系の間に存在し、ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血は、いくつかの血液細胞系統を生成するために空間的および時間的に異なる段階で起こります。両方のシステムが成熟した系統を展開したり交換すると、血液前駆細胞の貯水池を維持します。造血系は、 ショウジョウバエや哺乳類が応答すると免疫の課題に適応することができます。重要なのは、生成、保守、および造血系の機能を制御する転写調節因子およびシグナル伝達経路は、哺乳動物へのハエから保存されています。これらの類似性は、 ショウジョウバエは遺伝的モデル造血開発および疾患に使用することができます。
ここでは詳細なアッセイは、 ショウジョウバエの幼虫の造血系を検討しました。に特に、我々は、血液細胞数および濃度を測定生体内で特定の成熟した系統を視覚化し、循環中および造血器官に血液細胞の免疫組織化学法を実行するための方法を概説します。これらのアッセイは、遺伝子発現の変化及びシグナリング、生存、増殖、および分化を含む細胞プロセスを明らかにすることができるし、造血に関する質問の様々な調査するために使用することができます。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールと組み合わせて、これらのアッセイは、定義された遺伝的改変の際に造血系を評価するために使用することができます。具体的にここで説明されていないが、これらのアッセイは、造血系の、そのような感染症や食事などの環境変化の影響を調べるために使用できます。
Introduction
血液疾患における造血系の開発とその誤動作の座標転写因子およびシグナル伝達経路を調節する複雑なメカニズムはよくわかっていないままです。これらの転写因子およびシグナル伝達経路、ならびにそれらの調節は、非常にショウジョウバエおよび哺乳動物の造血1~5の間で保存されています。したがってショウジョウバエ造血系は、造血及び下地血液疾患を制御する分子機構を定義するための優れた遺伝的モデルを表します。
哺乳類と同様に、 ショウジョウバエは、造血の空間的および時間的に別個の相では、血球と呼ばれる、血液細胞を生成します。伝統的に、 ショウジョウバエの造血は、胚中胚葉にし、幼虫のリンパ腺に段階に限定されると考えられていました。最近の研究は、造血はまた、幼虫の無茎性のCLUで発生するという証拠を提供しますstersと6-8腹部大人インチplasmatocytesと液晶セル：すべての造血相は、成熟血球の2種類を生成します。 Plasmatocytesは食作用、先天性免疫、および創傷治癒に関与するマクロファージ様細胞です。クリスタル細胞がメラニン化のために必要なプロphenoloxidases、昆虫の免疫応答および創傷治癒に使用される反応が含まれています。幼虫の造血は、このような寄生蜂感染9,10などの特定の免疫の課題に応じて、lamellocyteと呼ばれる第三の成熟した血球タイプを、生成することができます。 Lamellocytesは、 ショウジョウバエの幼虫に敷設されたスズメバチの卵をカプセル化し、中和するために、plasmatocytesと液晶セルと組み合わせて、機能大、接着細胞です。寄生虫感染の非存在下で、lamellocytes野生型幼虫では見られません。メラニン質量はメラニン、カプセル化されたスズメバチの卵に似ています。多くの変異体ショウジョウバエ株は、寄生虫感染の非存在下での黒色腫瘤を開発します。 lamelloの存在球および/またはメラニンの塊は、造血異常を示すことができます。実際には、黒色質量表現型は、造血11-14に関与する遺伝子および経路を同定するために使用されています。
幼虫の造血系は、最も広く今日までに研究されています。それは、血リンパ中を循環血球、キューティクルの下にパターン化さ固着血球クラスター、およびリンパ腺に存在する血球から構成されています。リンパ腺は背容器に取り付けられた二国間のローブのシリーズです。リンパ腺の各一次ローブは、3つの主要な領域に分割されます。最も外側のゾーンは、皮質ゾーンとして知られており、成熟血球が含まれます。最も内側のゾーンは、髄質ゾーンと呼ばれ、静止血球前駆体から構成されています。第三ゾーン、後部のシグナリングセンターでは、幹細胞様ニッチとして機能リンパ腺の基部にある細胞の小グループです。初期の研究は、Notch 15-18のための重要な機能を確立しました</suP>、ヘッジホッグ19,20、JAK-STAT 18、および無翅21の活動は、幼虫のリンパ腺の開発を規制します。より最近の研究は、BMP 22、FGF-RAS 23、およびカバ24,25シグナリングはまた幼虫のリンパ腺内で機能することを実証しました。
ここで説明四幼虫造血アッセイ1を説明する）3） インビボでの液晶セルを可視化する、2）免疫組織化学のために循環血球を単離し、固定し、単位体積あたりの細胞数として定義血球濃度が、循環、及び4）、解剖固定、実装測定免疫組織化学のための腺リンパ。これらのアッセイは、幼虫の造血系内シグナル伝達経路の機能および規則を評価するために、造血読み出しとして使用することができます。これらのメソッドは、フィールドで以前に使用されてきたが、これらのアッセイの視覚的なドキュメントは、ごく最近8,26-30を開始しました。ここで引用したいくつかの刊行物は、ヘルプです同様の方法および造血マーカー26,31-33を説明FUL資源。さらに、TROLとバイキングは、リンパ腺の基底膜の有用なマーカーです。
Protocol
Representative Results
Discussion
遺伝的または環境の変化に応じ、ここで説明した4つの方法は、シグナル伝達、生存、増殖、および分化のような造血中に別個のプロセスを分析するために、個別に、または組み合わせて使用することができるショウジョウバエ造血は、動的なプロセスです。動物あたりの血球数が35増加し、リンパ腺の構造と遺伝子発現は、開発中に32を変更します 。これらの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
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