Métodos para examinar los nódulos linfáticos y en los hemocitos<em> Drosophila</em> Las larvas
Summary
Drosophila y sistemas hematopoyético de mamíferos comparten muchas características comunes, por lo que la Drosophila un modelo genético atractivo para estudiar la hematopoyesis. Aquí se demuestra la disección y el montaje de los principales órganos hematopoyéticos larvas para inmunohistoquímica. También describimos métodos para ensayar diversos compartimentos hematopoyéticas larvas incluyendo circulantes hemocitos y células de cristal sésiles.
Abstract
Existen muchos paralelismos entre los sistemas hematopoyético de mamíferos Drosophila y, a pesar de que carecen de la Drosophila linaje linfoide que caracterizan a la inmunidad adaptativa de los mamíferos. Drosophila y la hematopoyesis de mamíferos ocurren en fases distintas espacial y temporalmente para producir varios linajes de células sanguíneas. Ambos sistemas de mantenimiento de reservorios de células progenitoras de sangre con la que se ensanchan o se reemplazan los linajes maduros. El sistema hematopoyético permite Drosophila y mamíferos para responder y adaptarse a los desafíos inmunes. Es importante destacar que los reguladores transcripcionales y vías de señalización que controlan la generación, el mantenimiento, y la función del sistema hematopoyético se conservan de las moscas a los mamíferos. Estas similitudes permiten Drosophila que se utilizará para el desarrollo hematopoyético genéticamente modelo y la enfermedad.
Aquí ensayos detalle para examinar el sistema hematopoyético de las larvas de Drosophila. Enen particular, se describe métodos para medir el número de células de la sangre y la concentración, visualizar un linaje maduro específica in vivo, y llevar a cabo la inmunohistoquímica en células de la sangre en circulación y en el órgano hematopoyético. Estos ensayos pueden revelar cambios en la expresión génica y los procesos celulares, incluyendo la señalización, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación y pueden ser utilizados para investigar una variedad de cuestiones relativas a la hematopoyesis. En combinación con las herramientas genéticas disponibles en Drosophila, estos ensayos se pueden utilizar para evaluar el sistema hematopoyético en alteraciones genéticas definidas. Aunque no específicamente descrito aquí, estos ensayos también se pueden usar para examinar el efecto de las alteraciones ambientales, tales como la infección o de la dieta, en el sistema hematopoyético.
Introduction
Los complejos mecanismos que regulan los factores de transcripción y vías de señalización que coordinan el desarrollo del sistema hematopoyético y que funcionan mal en las enfermedades hematológicas siguen siendo poco conocidos. Estos factores de transcripción y vías de señalización, así como su regulación, están altamente conservadas entre Drosophila y mamíferos hematopoyesis 1-5. De este modo el sistema hematopoyético Drosophila representa un modelo genético excelente para definir los mecanismos moleculares que controlan la hematopoyesis y enfermedades hematológicas subyacentes.
De manera similar a los mamíferos, Drosophila generan células de la sangre, llamados hemocitos, en fases espacial y temporalmente diferentes de la hematopoyesis. Tradicionalmente, se pensó Drosophila hematopoyesis estar restringida a las fases en el mesodermo embrionario y en la glándula de linfa larval. Estudios recientes proporcionan evidencia de que la hematopoyesis también se produce en clu sésiles larvalSters y en el abdomen adulto 6-8. Todas las fases hematopoyéticas producen dos tipos de hemocitos maduros: plasmatocitos y células de cristal. Plasmatocitos son células similares a los macrófagos que participan en la fagocitosis, la inmunidad innata y la cicatrización de heridas. células de cristal contienen pro-fenoloxidasas necesarios para melanización, una reacción utilizado en las respuestas inmunes de insectos y la cicatrización de heridas. La hematopoyesis de las larvas puede generar un tercer tipo de hemocitos maduro, llamado lamellocyte, en respuesta a ciertos desafíos inmunes tales como la infección de la avispa parasitoide 9,10. Lamellocytes son células grandes, que funcionan adherentes, en conjunción con plasmatocitos y células de cristal, para encapsular y neutralizar huevos de avispa establecidas en larvas de Drosophila. En ausencia de parasitación, lamellocytes no se encuentran en larvas de tipo salvaje. masas melanotic asemejan melanizados, huevos de avispa encapsulados; muchas cepas mutantes de Drosophila se desarrollan masas melanotic en ausencia de parasitación. La presencia de Lamellocitos y / o masas melanotic pueden ser indicativos de anomalías hematopoyéticas. De hecho, el fenotipo de masa melanotic se ha utilizado para identificar los genes y las vías de señalización implicadas en la hematopoyesis 11-14.
El sistema hematopoyético larval es el más estudiado hasta la fecha. Se compone de hemocitos que circulan en la hemolinfa, las agrupaciones de hemocitos sésiles estampadas debajo de la cutícula, y hemocitos residente en el ganglio linfático. El ganglio linfático es una serie de lóbulos bilaterales unidos al vaso dorsal. Cada lóbulo principal de la glándula linfática se divide en tres zonas principales. La zona más externa se conoce como la zona cortical y contiene maduración hemocitos. La zona más interna se llama la zona medular y se compone de precursores de hemocitos quiescentes. La tercera zona, el centro de señalización posterior, es un pequeño grupo de células en la base de la glándula de linfa que actúan como un nicho de células madre similares. Los primeros trabajos estableció las funciones críticas de Notch 15-18 </sup>, erizo 19,20, JAK-STAT 18, y la actividad sin alas 21 para regular el desarrollo de las larvas de los ganglios linfáticos. Estudios más recientes han demostrado que la BMP 22, FGF-Ras 23, y la señalización del hipopótamo 24,25 también funcionan dentro de la glándula linfática de las larvas.
Cuatro ensayos hematopoyéticas larvas descritos aquí describen 1) la medición de circulación concentración de hemocitos, que se define como el número de células por unidad de volumen, 2) el aislamiento y la fijación de circulación hemocitos para inmunohistoquímica, 3) la visualización de células de cristal in vivo, y 4) la disección, fijación, y el montaje glándulas linfáticas para inmunohistoquímica. Estos ensayos se pueden utilizar como lecturas hematopoyéticas para evaluar las funciones y los reglamentos de las vías de señalización en el sistema hematopoyético larval. Mientras que estos métodos han sido utilizados previamente en el campo, la documentación visual de estos ensayos sólo recientemente ha comenzado 8,26-30. Varias publicaciones aquí citadas se ayudaful recursos que describen métodos similares y marcadores hematopoyéticos 26,31-33. Además, Trol y Viking son marcadores útiles de la membrana basal de los nódulos linfáticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tras la alteración genética o ambiental, los cuatro métodos descritos aquí pueden ser utilizados individualmente o en combinación para analizar procesos distintos durante la hematopoyesis, tales como señalización, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación de Drosophila hematopoyesis es un proceso dinámico.; el número de hemocitos por animal aumenta 35 y la expresión de genes y la estructura de la glándula de linfa cambia 32 durante el desarrollo. Antes de realizar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. 遗传学. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. 遗传学. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
