This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
Transductie-transplantatie is een bruikbare methode voor hematologische maligniteiten model bij muizen. Deze techniek is bijzonder waardevol voor het bestuderen van myeloïde maligniteiten die teruggaat tot de eerste demonstratie dat ectopische expressie van BCR-ABL1 trouw kon recapituleren chronische myeloïde leukemie in muizen 1 geweest. Deze techniek is vervolgens vergemakkelijkt de uitgebreide studie van JAK2 V617F en MPL W515K / L gemuteerd myeloproliferatieve aandoening (MPN).
MPN zijn een groep van hematologische kwaadaardigheden welke door de overproductie van rijpe myeloïde cellen en beenmerg fibrose. Deze ziekten meestal voort uit de klonale expansie van een hematopoietische stamcel die een somatische mutatie in beide Jak2, MPL of CALr heeft verworven. Transductie-transplantatie JAK2 V617F en MPL W515K / L-modellen vertonen de klinische kenmerken van polycytemie vera en myelofibrosis 2-5 </ Sup>. Onlangs heeft een muismodel van calreticuline gemuteerde MPN is ook gemaakt met de transductie-transplantatie methode 6. Deze muizen ontwikkelen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met verhoogde bloedplaatjes, verhoogd aantal megakaryocyten en beenmerg fibrose. Samen hebben deze modellen niet alleen de gelegenheid om inzicht te krijgen in de moleculaire pathogenese van MPN, maar ook het vermogen ontwikkelen en therapie te bestuderen in een pre-klinische setting.
Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van transductie-transplantatie methode met een focus op de CALRdel52 mutatie. Deze techniek houdt transplantatie van retroviraal getransduceerde beenmergcellen expressie het mutante construct in bestraalde syngene ontvangende muizen.
Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het beenmerg transplantaties uitgevoerd bij muizen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met progressie herhalen om myelofibrose met CALRdel52 mutatie als de bestuurder van ziekte. Succesvolle transplantatie van cellen die CALRdel52 resulteert in verhoogde bloedplaatjes, uitbreiding van megakaryocyten en beenmerg fibrose. Beenmerg transplantatie een meerstaps proces is het belangrijk om stappen waarbij technische fout kan worden vermeden slechte engraftment v…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
CELL LINES | |||
DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
PLASMIDS | |||
EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
CONSUMABLES | |||
27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
10cm dishes | Fisher | 172931 | |
15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
60mm dishes | Fisher | 150288 | |
Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
5-FU | Fisher | A13456-06 | |
100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
6-well plate | Fisher | 130184 | |
FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
EQUIPMENT | |||
BD Accuri C6 | |||
X-ray irradiator |