Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien
Summary
This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Abstract
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
Introduction
Transduktion-Transplantation ist eine nützliche Methode hämatologischen Malignomen in Mäusen zu modellieren. Diese Technik ist besonders wertvoll myeloischen malignen Erkrankungen , für das Studium an der ersten Demonstration aus dem Jahr die ektopische Expression von BCR-ABL1 getreulich chronischer myeloischer Leukämie in Mäusen 1 rekapitulieren könnte. Diese Technik hat in der Folge der umfangreichen Studie von JAK2 V617F und MPL W515K / L mutierten myeloproliferativen Neoplasien (MPN) erleichtert.
MPN sind eine Gruppe von hämatologischen durch die Überproduktion von reifen myeloischen Zellen und Knochenmarkfibrose gekennzeichnet malignen Erkrankungen. Diese Krankheiten im Allgemeinen ergeben sich aus der klonalen Expansion einer hämatopoetischen Stammzellen, die eine somatische Mutation in entweder Jak2, MPL oder CALR erworben hat. Transduction-Transplantation JAK2 V617F und MPL W515K / L – Modelle zeigen die klinischen Merkmale von Polyzythämie und Myelofibrose 2 bis 5 </ Sup>. Vor kurzem wurde ein Mausmodell für Calreticulin-mutierten MPN auch mit der Transduktion-Transplantationsverfahren 6 erzeugt worden ist . Diese Mäuse eine essentielle Thrombozythämie-ähnliche Erkrankung mit einem erhöhten Blutplättchen, erhöhte Anzahl von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose entwickeln. Zusammen haben diese Modelle nicht nur bot die Gelegenheit, einen Einblick in die molekularen Pathogenese der MPN zu gewinnen, sondern auch die Fähigkeit Therapeutika in einer präklinischen Einstellung zu entwickeln und zu studieren.
Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Transduktion-Transplantation Methodik mit einem Schwerpunkt auf der CALRdel52 Mutation. Diese Technik beinhaltet die Transplantation von retroviral transduzierte Knochenmarkszellen exprimieren die Mutante in bestrahlte syngene Empfängermäuse konstruieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Beschreibung, wie Knochenmark-Transplantationen bei Mäusen führen ein wesentlicher thrombocythemia ähnliche Erkrankung mit Progression zu Myelofibrose mit CALRdel52 Mutation als Treiber der Krankheit zu rekapitulieren. Erfolgreiche Transplantation von Zellen CALRdel52 führt zu einer erhöhten Thrombozyten Expansion von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose exprimieren. Als Knochenmarktransplantation ein mehrstufiger Prozess ist, ist es wichtig, Maßnahmen zu erkennen, wo tec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
Materials
| CELL LINES | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| PLASMIDS | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| CONSUMABLES | |||
| 27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
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