הכנה<em> In vivo</em> השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em> N</em> -acylethanolamine חומצה Amidase
Summary
כאן, אנו מתארים את ההכנה והשימוש תחקיר מבוססי פעילות (ARN14686, undec-10-ynyl- N – [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) המאפשר איתור וכימות של צורה פעילה של amidase החומצה המעודד דלקת אנזים N -acylethanolamine (NAAA), הוא במבחנת vivo לשעבר.
Abstract
פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) הוא שיטה לזיהוי של אנזים של עניין proteome מורכב באמצעות בדיקה כימית שמכוונת את האתר הפעיל של האנזים. תג כתב הציג לתוך החללית מאפשר זיהוי של האנזים שכותרתו ידי סריקת קרינה-ג'ל, כתם חלבון, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית. כאן, אנו מתארים את ההכנה ושימוש של ARN14686 המתחם, כימיה לחץ פעילות מבוססת בדיקה (CC-ABP) באופן סלקטיבי מזהה אנזים N -acylethanolamine חומצת amidase (NAAA). NAAA הוא hydrolase ציסטאין שמקדם דלקת ידי השבתת peroxisome אנדוגני קולטן proliferator המופעל (PPAR) אגוניסטים -alpha כגון palmitoylethanolamide (PEA) ו oleoylethanolamide (OEA). NAAA הוא מסונתז כקובץ proenzyme באורך מלא פעיל, אשר מופעל על ידי autoproteolysis ב- pH חומצי של ליזוזום. מחקרי לוקליזציה hותעיף הראה כי NAAA מתבטא בעיקר מקרופאגים ותאי מונוציטים נגזרות אחרים, וכן לימפוציטים מסוג B. אנו מספקים דוגמאות כיצד ניתן להשתמש ARN14686 כדי לזהות ולכמת פעיל NAAA vivo לשעבר ברקמות מכרסמים על ידי כתם חלבון מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Introduction
בשימוש נפוץ שיטות לחקור את דפוסי הביטוי, אינטראקציות, ופונקציות של חלבונים, כולל פלטפורמות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזליות לניתוח רובה 1,2, שמרים שיטות שני היברידיות 3,4, ו ב מבחני חוץ גופייה, מוגבלות שהם לא ניתן להעריך את הפעילות של חלבונים במצב הטבעי שלהם. פרופיל חלבון מבוססי פעילות (ABPP) שניתן להשתמש בהם כדי למלא את הפער. לפי גישה זו, מולקולות קטנות בוחנות מסוגלות מחייב קוולנטית אל האתר הפעיל של אנזים אינטרסים מצומדות לקבוצת כתב המאפשרת איתור היעד. באמצעות כימיה לחץ (CC), הכתב ניתן לשלב את החללית או יכול להיות מוצג לאחר אירוסי היעד התרחשו 5,6. ההליך האחרון מחייב שימוש בדיקות המכילות קבוצות כימיות מתאימות, כגון אלקין או תזיד מסוף, אשר יכול להיות שונה עם מספר ריאגנטים כתב דרך תגובות ביו-מאונך such כמו Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 או Staudinger קשירת 10,11.
לאחרונה, אנו חשפנו את ARN14686 המתחם כמו ABP הראשון עבור במבחנת איתור vivo של hydrolase ציסטאין, 12 NAAA. NAAA מזרז את שחרור משרות והידרוליזה של FAES רווי בלתי רווי, כולל oleoylethanolamide (OEA) ו palmitoylethanolamide (PEA), שהן אגוניסטים אנדוגני של רצפטור גרעיני אנטי דלקתיות PPAR-alpha 13-15. NAAA מתבטא בעיקר מקרופאגים ותאי מונוציטים הנגזרות אחרים, כמו גם ב-לימפוציטים 14,16, דבר המצביע על תפקיד בוויסות התגובה החיסונית המולדת. האנזים הוא מסונתז reticulum endoplasmic המחוספס בצורה פעילה מופעל בתאים החומצית של התא על ידי מנגנון autoproteolytic 17. מחשוף autoproteolytic יוצר ציסטאין חדש N -terminal (C131 בעכברים וחולדות, C126 בבני אדם), כי הוא אחראי נוקלאופיל עבור FAE הידרוליזה 18,19. עיכוב תרופתי פעילות NAAA משנה את איזון FAE סינתזה / שפלה לטובת רמות תאיים מרובות יותר של 16,20,21 FAES. כמה נגזרים β-lactone ו β-לקטם הוכחו לעכב פעילות NAAA עם עוצמה גבוהה סלקטיביות 16,22-26. מעכבים אלה פועלים באמצעות S -acylation של ציסטאין קטליטי 16,27,28.
ARN14686 המתחם תוכנן בהתבסס על המבנה הכימי של פעיל מערכתית, נגזר-סרין β-לקטם NAAA מעכב, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N – [(S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) 16. קבוצת 4-בוטיל-cyclohexyl של ARN726 הוחלפה שרשרת אליפטיות רווי C9 נושאות תג אלקין מסוף נטיית CC הבאה עם תג עיתונאי יזיד נושאות. בחרנו לעצב ABP שני שלבים כדי minimally לשנות את מבנה הפיגום המקורי, ובכך שמירה על הזיקה של החללית עבור NAAA. יתר על כן, הימנעות כניסתה של תגים מגושמים, בדיקה כזו יכולה להיות מתאימה יותר לטיפול in vivo מאשר ABP ישיר. ARN14686 מעכב NAAA עם עוצמה גבוהה (hNAAA IC 50 = ננומטר 6, rNAAA IC 50 = 13 ננומטר) על ידי יצירת adduct קוולנטיים עם ציסטאין הקטליטית של האנזים 12. ניסויים בחולדות חיים הראו כי החללית היא סלקטיבית לכידה NAAA לידי ביטוי ריאות. חומצה ceramidase, אחר ציסטאין amidase שחולקת זהות 33-34% עם NAAA, זוהה גם כמטרה בעלת זיקה נמוכה בעת שימוש בריכוזים גבוהים בדיקה (10 מיקרומטר במבחנה, 10 מ"ג / מ"ל תוך ורידי, iv) 12. יש לנו גם השתמשתי ARN14686 ללמוד בנוכחות NAAA הפעיל ברקמות עכברוש מודלקות לאחר נטילה של אדג'ובנט של שלמה פרוינד (CFA) 29.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור preparatiעל של ARN14686 (איור 1) ויישומה לחקירת ההפעלה NAAA vivo לשעבר. כדוגמה, אנו מתארים הליך הניסוי לדמיין NAAA בכפות עכברוש לאחר מתן CFA. בניסוי זה, חלבונים המחולצים רקמות כפה לאחר ההזרקה iv של החללית, ואת proteome שכותרתו ABP הוא נתון סמ"ק עם-אזיד ביוטין. דגימות Biotinylated מועשרות באמצעות חרוזי streptavidin, וכתמי חלבון מבוצעים. ביישום אחר, אנו מתארים את הלוקליזציה של NAAA הפעיל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך ריאות עכבר מעכברים שטופל חללית. במקרה זה, הרקמה מחולקת וחתכים חשופים CC עבור בנוסף rhodamine. ערכת עבודה מתוארת באיור 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
פעילות האנזים מוסדר דק ברמות שונות, כולל שעתוק RNA, סינתזת החלבון, טרנסלוקציה חלבון, שינוי שלאחר translational, ואינטראקציה בין חלבונים. לעתים קרובות, ביטוי האנזים אינו לבד חשבון עבור פעילותה. ABPP פותח כדי לחקור את פעילותם של חלבונים במצב הטבעי שלהם. שתי תכונות נדרשות: בדיקה כי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
- Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
- Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
- Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
- Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
- Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
- Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
- Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
- Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
- Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
- Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
- Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
- Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
- West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
- Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
- Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
- Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
- Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
- Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
- Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
- Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
- Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
- Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
- Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund’s Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
- Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
- Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
- Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
- Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).
