Preparación y<em> En Vivo</em> El uso de una sonda basada en la actividad de<em> N</em> -acylethanolamine Ácido amidasa
Summary
Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N – [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.
Abstract
perfiles de proteínas basado en las actividades (ABPP) es un método para la identificación de una enzima de interés en un proteoma complejo mediante el uso de una sonda química que se dirige a los sitios activos de la enzima. Una etiqueta de reportero introducido en la sonda permite la detección de la enzima marcada por el análisis en gel de fluorescencia, transferencia de proteínas, la microscopía de fluorescencia, o la espectrometría de cromatografía de masa líquida. Aquí, se describe la preparación y uso de la ARN14686 compuesto, una sonda basada en la actividad de química (CC-ABP) que reconoce selectivamente la enzima N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA). Naaa es una hidrolasa cisteína que promueve la inflamación mediante la desactivación de los agonistas alfa endógenos receptor activado por el proliferador de peroxisomas-(PPAR), tales como palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA). NAAA se sintetiza como una proenzima inactiva de longitud completa, que se activa por autoproteolisis en el pH ácido del lisosoma. Los estudios de localización have muestra que NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B. Proporcionamos ejemplos de cómo ARN14686 se puede utilizar para detectar y cuantificar NAAA activo ex vivo en los tejidos de roedores por transferencia de proteínas y microscopía de fluorescencia.
Introduction
Comúnmente utilizado métodos para investigar los patrones de expresión, interacciones y funciones de las proteínas, incluyendo las plataformas de cromatografía de espectrometría de masas para el análisis de líquidos escopeta 1,2, levadura de dos híbridos de métodos 3,4, y en ensayos in vitro, están limitadas en cuanto a que son no se puede evaluar la actividad de las proteínas en su estado nativo. basados en la actividad de proteína de perfiles (ABPP) se puede utilizar para llenar este vacío. En este enfoque, las sondas de molécula pequeña capaz de unirse covalentemente al sitio activo de una enzima de interés se conjugan con un grupo indicador que permite la detección de blancos. El uso de la química clic (CC), el reportero puede ser integrado en la sonda o puede ser introducido después del acoplamiento de destino se ha producido 5,6. El último procedimiento requiere el uso de sondas que contienen grupos químicos apropiados, tales como un alquino o azida de terminal, que puede ser modificado con un número de reactivos de reportero a través de reacciones bio-ortogonal such como el Cu (I) catalizada Huisgen [3 + 2] cicloadición 7-9 o Staudinger ligadura 10,11.
Recientemente, hemos revelado el ARN14686 compuesto como la primera ABP para la detección in vitro y in vivo de la hidrolasa cisteína, NAAA 12 en. NAAA cataliza la desactivación hidrolítica de FAEs saturados y monoinsaturados, incluyendo oleoiletanolamida (OEA) y palmitoiletanolamida (PEA), que son agonistas endógenos de la anti-inflamatoria receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B 14,16, lo que sugiere un papel en la regulación de la respuesta inmune innata. La enzima se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso en una forma inactiva y se activa en los compartimientos ácidos de la célula por un mecanismo autoproteolítica 17. La escisión autoproteolítica genera una nueva cisteína-terminal de N (C131 en ratones y ratas, C126 en los seres humanos), que es el nucleófilo responsable de FAE hidrólisis 18,19. La inhibición farmacológica de la actividad naaa altera el equilibrio de síntesis / degradación de la FAE en favor de un aumento de los niveles celulares de FAE 16,20,21. Varios derivados de β-lactona y β-lactámicos se ha demostrado que inhiben la actividad de NAAA con alta potencia y selectividad 16,22-26. Estos inhibidores actúan a través de S acilación de la cisteína catalítica 16,27,28.
El ARN14686 compuesto fue diseñado sobre la base de la estructura química de la, inhibidor de la β-lactama NAAA serina derivados sistémicamente activo, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- – [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) 16. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal para la posterior conjugación CC con una etiqueta de reportero azida-cojinete. Hemos elegido para diseñar un SPA de dos pasos para MiniMally alterar la estructura del andamio original, manteniendo así la afinidad de la sonda para NAAA. Además, evitando la introducción de etiquetas voluminosos, una sonda de este tipo podría ser más adecuado para el tratamiento in vivo de un directo ABP. ARN14686 inhibe NAAA con alta potencia (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) mediante la formación de un aducto covalente con la cisteína catalítica de la enzima 12. Experimentos en ratas vivas mostraron que la sonda es selectiva en la captura de NAAA expresa en pulmones. Ceramidasa ácida, otra amidasa cisteína que comparte 33-34% de identidad con NAAA, también fue identificado como un objetivo de baja afinidad utilizando las altas concentraciones de sonda (10 micras de vitro, 10 mg / ml por vía intravenosa, iv) 12. También hemos utilizado ARN14686 para estudiar la presencia de NAAA activo en tejidos de rata inflamadas después de la administración de adyuvante completo de Freund (CFA) 29.
A continuación, se describe un protocolo para los preparatien de ARN14686 (Figura 1) y su aplicación a la investigación de la activación NAAA ex vivo. Como ejemplo, se describe un procedimiento experimental para visualizar NAAA en patas de rata después de la administración CFA. En este experimento, las proteínas se extrajeron a partir de tejido de la pata después de la inyección iv de la sonda, y el proteoma marcado-ABP es sometido a CC con biotina-azida. muestras biotiniladas se enriquecen usando perlas de estreptavidina, y se llevan a cabo transferencias de proteínas. En otra aplicación, se describe la localización de NAAA activo por microscopía de fluorescencia en los pulmones del ratón de los ratones tratados con la sonda. En este caso, el tejido se seccionó y las secciones se someten a CC para la adición de rodamina. Un esquema de flujo de trabajo se ilustra en la Figura 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
La actividad enzimática se finamente regulada a diferentes niveles, incluyendo la transcripción de ARN, síntesis de proteínas, la translocación de proteínas, modificación después de la traducción, y la interacción proteína-proteína. A menudo, la expresión de la enzima sola no tiene en cuenta para su actividad. ABPP fue desarrollado para estudiar la actividad de las proteínas en su estado nativo. Se requieren dos características: una sonda química que se une covalentemente al sitio activo de una enzima de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
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