Hazırlama ve<em> İn Vivo</em> Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em> K</em> -acylethanolamine Asit aminidaz
Summary
Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N – [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.
Abstract
Aktivite bazlı protein profili (ABPP) enzimin aktif sitesi hedef kimyasal sistemlerinin kullanımı ile kompleks proteomun daki bir enzimin tanımlanması için bir yöntemdir. sonda içine bir raportör etiketi-jel floresans tarama protein blot, floresan mikroskobu ya da sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile etiketlenmiş enzim algılanmasına olanak verir. Burada, hazırlanması ve bileşik ARN14686 kullanımını seçici enzim N -acylethanolamine asit amidaz (NAAA) tanıdığı bir tıklama kimya faaliyet tabanlı prob (CC-ABP) açıklar. NAAA örneğin palmitoiletanolamidi (PEA) ve oleoylethanolamide (OEA) gibi endojen peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör (PPAR) -alfa agonistleri devre dışı bırakarak iltihabı teşvik eden bir sistein hidrolazdır. NAAA lizozom asidik pH autoproteolysis ile aktive edilen bir aktif olmayan, tam uzunlukta bir proenzim olarak sentezlenir. Lokalizasyon çalışmaları hNAAA ağırlıklı B-lenfositlerinde ve, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücrelerde eksprese olduğu gösterilmiştir ave. Biz ARN14686 tespit ve protein blot ve floresan mikroskobu ile kemirgen dokularında aktif NAAA ex vivo olarak ölçmek için kullanılabilir şeklinin örneklerini sağlar.
Introduction
Yaygın tüfek analizi 1,2, maya için sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi platformları içeren ekspresyonu, etkileşimler ve işlevleri proteinlerin araştırmak için yöntem kullanılan iki hibrid yöntemler 3,4 ve in vitro deneyler, bu olmasıyla sınırlıdır kendi doğal yapısında proteinlerinin aktivitesini değerlendirmek mümkün. Etkinlik bazlı protein profilleme (ABPP) bu boşluğu doldurmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, küçük moleküllü kovalent hedef saptama için izin veren bir raportör gruba konjuge edilmiş bir ilgi enzimin aktif bölgesine bağlanabilen probes. Tıklama kimyası (CC) kullanarak, muhabir prob entegre edilebilir veya hedef nişan 5,6 oluştuktan sonra sokulabilir. İkinci prosedür, suc biyo-dik reaksiyonlar vasıtasıyla haberci reaktif bir dizi modifiye edilebilir bir terminal alkin veya azid gibi uygun kimyasal gruplar ihtiva eden sondalannın kullanılmasını gerektirirCu (I) H [3 + 2] siklo-7-9 ya da Staudinger ligasyon 10,11 Hüsgen, paladyum.
Son zamanlarda, in vitro ilk ABP gibi sistein hidrolaz, NAAA 12 in vivo tespiti bileşik ARN14686 tarif. NAAA antienflamatuar nükleer reseptör PPAR-alfa 13-15 endojen agonistleri olan oleoylethanolamide (OEA) ve palmitoiletanolamidi (PEA) de dahil olmak üzere doymuş ve tekli doymamış FAES, hidrolitik devreden katalize eder. NAAA ağırlıklı doğal bağışıklık tepkisinin düzenlenmesinde önemli bir rol öne hem de B-lenfositleri 14,16 olarak, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücre olarak ifade edilir. Enzim, bir aktif olmayan formda endoplazmik retikulum içinde sentezlenir ve otoproteolitik mekanizması 17 hücrenin asidik bölümlerinde aktive edilir. Otoproteolitik klevaj (C13 Yeni N-terminal sisteini üretirFare ve sıçanlarda 1, insanlarda 126P), bu FAE için nükleofil sorumlu 18,19 hidrolizidir. NAAA aktivitesinin farmakolojik inhibisyonu FAEler 16,20,21 artmış hücresel seviyedeki lehine FAE sentezini / yıkımını dengesini değiştirir. Çeşitli β-lakton ve β-laktam türevleri, yüksek bir potansiyel ve seçicilik 16,22-26 ile NAAA aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu inhibitörler, katalitik sistein 16,27,28 S -acylation olarak hareket eder.
(- [(S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat 4-cyclohexylbutyl- K) 16 bileşiği, ARN14686 sistemik aktif serin türevi β-laktam NAAA inhibitörünün kimyasal yapısı, ARN726 göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir azid taşıyan raportör etiketi ile müteakip CC konjügasyonu için bir terminal alkin etiket taşıyan bir C9 doymuş alifatik zinciri ile ikame edilmiştir. Biz minimall için iki adımlı bir ABP tasarımı seçtiy böylece NAAA için prob afinite koruyarak, orijinal iskele yapısını değiştirebilir. Ayrıca, hacimli etiketlerin giriş kaçınarak, bir sonda, bir doğrudan ABP daha canlılarda tedavi için daha uygun olabilir. ARN14686 yüksek etki ile NAAA inhibe enzim 12 katalitik sistein ile kovalent bir katılma ürünü oluşturmak suretiyle (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM). canlı farelerde deneyler prob NAAA akciğerlerde ifade yakalama seçici olduğunu göstermiştir. Yüksek prob konsantrasyonunu (in vitro 10 uM, 10 mg / damar içi, iv mi) 12 kullanılarak, asit seramıdaz, NAAA ile 33-34% özdeşlik paylaşan başka sistein amidaz, aynı zamanda, düşük afiniteli bir hedef olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, tam Freund adjuvanı (CFA) 29 uygulanmasından sonra iltihaplı sıçan dokularında aktif NAAA varlığını incelemek için ARN14686 kullandık.
Burada, Preparati için bir protokol anahatARN14686 (Şekil 1) ve NAAA aktivasyonu ex vivo soruşturma onun uygulaması üzerinde. Bir örnek olarak, CFA tatbikatından sonra sıçan pençelerde NAAA görselleştirmek için deneysel bir prosedürü açıklar. Bu deneyde, protein sondanın IV enjeksiyonundan sonra pençe dokusundan ekstre edilir ve ABP-etiketli proteom biyotin-azid ile CC tabi tutulur. Biyotinile örnekleri streptavidin boncuk kullanılarak zenginleştirilmiş ve protein lekeler yapılmaktadır. Başka bir uygulamada, prob ile tedavi edilen farelerden alınan fare akciğerlerinde floresan mikroskobu aktif NAAA lokalizasyonunu tarif etmektedir. Bu durumda, dokunun kesit bölümleri ve rodamin ilave edilmesi için CC tabi tutulur. Bir iş akışı şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enzim aktivitesi ince RNA transkripsiyonu, protein sentezi, protein translokasyon, post-translasyonel modifikasyon ve protein-protein etkileşimi dahil olmak üzere farklı seviyelerde düzenlenir. Genellikle, enzim ifadesi tek başına faaliyeti hesaba katmaz. ABPP kendi doğal yapısında proteinlerin aktivitesi çalışma için geliştirilmiştir. İki özellik gereklidir: kovalent olarak ilgi bir enzim ve bir raportör etiketi aktif sitesine bağlanan kimyasal bir sonda prob etiketli enzim tespit etmek.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
- Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
- Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
- Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
- Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
- Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
- Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
- Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
- Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
- Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
- Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
- Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
- Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
- West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
- Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
- Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
- Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
- Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
- Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
- Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
- Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
- Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
- Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
- Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund’s Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
- Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
- Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
- Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
- Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).
