Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em> Ex Vivo</em> Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Lo sviluppo di biomateriali ha aumentato significativamente il potenziale per la consegna mirato di farmaci ad una varietà di tipi di cellule e tessuti, incluse le cellule beta del pancreas. Inoltre, biomateriale particelle, idrogel, e ponteggi offrono anche l'opportunità unica di amministrare sostenuta, controllabile somministrazione di farmaci ai beta-cellule in coltura e nei modelli di tessuto trapiantato. Queste tecnologie permettono lo studio dei fattori di proliferazione candidato β-cellule utilizzando isolotti intatti e un sistema di traslazione rilevante. Inoltre, determinare l'efficacia e la fattibilità di fattori candidati per stimolare la proliferazione delle cellule β-in un sistema di coltura è fondamentale prima di andare avanti a modelli in vivo. Qui, si descrive un metodo di co-coltura isole di topo intatte con composti biodegradabili di interesse (COI) poli MOLLA (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) microsfere al fine di valutare gli effetti della sostenuta in situ rilascio ofattori mitogeni F sulla proliferazione β-cellule. Questa tecnica viene descritto in dettaglio come generare microsfere di PLGA contenenti un carico desiderato utilizzando reagenti commercialmente disponibili. Mentre la tecnica descritta utilizza fattore ricombinante umano connettivo crescita tissutale (rhCTGF), come esempio, potrebbe essere facilmente utilizzata un'ampia varietà di COI. Inoltre, questo metodo utilizza piastre a 96 pozzetti per minimizzare la quantità di reagenti necessarie per valutare la proliferazione β-cellule. Questo protocollo può essere facilmente adattato per usare biomateriali differenti e altre caratteristiche cellulari endocrine come la sopravvivenza delle cellule e lo stato di differenziazione.
Introduction
Pancreatiche beta-cellule sono le uniche cellule che producono insulina nel corpo e sono fondamentali per mantenere l'omeostasi del glucosio nel sangue. Mentre gli individui sani hanno massa β-cellule sufficienti e la funzione di regolare correttamente il glucosio nel sangue, le persone con diabete sono caratterizzati da massa β-cellule insufficiente e / o la funzione 1,2. E 'stato proposto che induce la proliferazione delle cellule β-in ultima analisi può aumentare la massa β-cellulare e ripristinare l'omeostasi del glucosio nei soggetti con diabete 3. Tuttavia, la valutazione e la validazione di potenziali composti proliferative β-cellule in isolotti intatto è necessario, prima di terapie efficaci possono essere sviluppate. Il trapianto di isole umane cadavere in individui con diabete di ripristinare l'omeostasi del glucosio nel sangue per un certo tempo, ma la disponibilità e il successo di questa procedura sperimentale è ostacolato da una carenza di isole umane disponibili per il trapianto e la morte delle cellule beta nelle isole di poppaER trapianto 4. Anche con la scoperta di fattori che inducono la moltiplicazione delle cellule che producono insulina, una sfida importante esiste ancora nella realizzazione di questi fattori per siti rilevanti in vivo. Una strategia per la consegna locale sostenuto di composti proliferative β-cellule è il poli (lattico-co-glicolico) Acido (PLGA). PLGA ha una storia di uso in prodotti approvati dalla FDA di consegna della droga a causa della sua elevata sicurezza, biodegradabilità, e cinetica di rilascio prolungato 5. In particolare, PLGA è un copolimero di lattide e glicolide che degrada per idrolisi con acqua in vivo o in coltura in acido lattico e acido glicolico, che sono naturalmente presenti metaboliti nel corpo. Il composto farmaco incapsulato può essere rilasciato nell'ambiente circostante sia diffusione e / o meccanismi di rilascio di degradazione controllata. Incapsulamento di COI fornisce protezione contro la degradazione enzimatica, migliorando la biodisponibilità del reagente rispetto a unencapsulaTed COI 5. Si consiglia di microsfere di PLGA può essere utilizzato per amministrare composti candidati a isolotti intatti nella cultura, e in ultima analisi in vivo. Testare l'efficacia di PLGA per amministrare mitogeni β-cellule di isolotti ex vivo è fondamentale prima di protocolli di trapianto sono esplorate.
Attualmente, non esiste una tecnica per misurare la proliferazione β-cellule di animali vivi. Gli esperimenti per valutare l'efficacia di potenziali composti proliferative in vivo quindi richiedere la somministrazione di questi composti per animali vivi, con successiva dissezione e lavorazione di pancreas per immunomarcatura. Tali protocolli sono costosi e laboriosi e richiedono il composto deve essere somministrato per via sistemica, senza alcuna garanzia che raggiungeranno gli isolotti. Viceversa, diverse linee β-cellulari immortalizzate sono disponibili per lo studio delle cellule che producono insulina in coltura, ma queste linee cellulari mancano l'architettura isolotto e environment trovato negli organismi viventi 6. Linee β-cellulari immortalizzate sono anche caratterizzati come aventi un più alto grado di replicazione di endogene beta cellule in vivo, complicando l'analisi di composti che inducono la proliferazione così. In questo studio, si descrive un protocollo che utilizza isolotti intatti isolati da topi adulti. A differenza di linee di β-cellule, isolotti intatti conservano normale architettura isolotto. Allo stesso modo, a differenza di esperimenti condotti in vivo, il funzionamento composti proliferative direttamente isolotti intatti coltura riduce significativamente la quantità di reagenti che è necessario misurare con precisione la proliferazione β-cellule.
L'attuale studio utilizza PLGA per amministrare un COI, in questo esempio, fattore ricombinante umano del tessuto connettivo della crescita (rhCTGF). Il metodo qui descritto conferisce un vantaggio significativo rispetto la somministrazione del composto grezzo di isolotti coltivate in quanto consente un rilascio continuo di composto in the media. In particolare, questo dosaggio può essere modificato per gestire un'ampia varietà di proteine e anticorpi di interesse per isolette intatte. Effetti su altri tipi di cellule endocrine, tra cui alfa-cellule, possono anche essere analizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio della proliferazione β-cellule in coltura è tipicamente ostacolato da diverse difficoltà. In primo luogo, le linee β-cellule immortalati sono caratterizzati da elevati livelli di proliferazione di quello che si trova in endogene cellule beta nelle isole dal vivo. Inoltre, queste linee cellulari immortalizzate mancano della normale architettura critica per la normale funzione β-cellule. Questi due fatti rendono difficile determinare se i risultati ottenuti utilizzando immortalati linee β-cellule terrà ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
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