La boucle artério (AV) dans un modèle Small Animal pour étudier l'angiogenèse et du génie tissulaire vascularisé

Summary

Nous décrivons une méthode microchirurgie pour la génération d'une boucle artérioveineuse (AV) en tant que modèle pour l' analyse de la vascularisation in vivo dans un environnement isolé et bien caractérisés. Ce modèle est non seulement utile pour l'étude de l'angiogenèse, mais est également parfaitement adaptée pour l'ingénierie axialement vascularisé et les tissus transplantables.

Abstract

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient’s needs.

Introduction

La plupart des tissus et des organes du corps humain dépendent d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnels qui fournit des nutriments, échange des gaz et supprime les déchets. Dysfonctionnement du système causé par des problèmes vasculaires locales ou systémiques peut conduire à une multitude de maladies graves. En outre, dans des domaines de recherche tels que l'ingénierie tissulaire ou la médecine régénérative, un réseau de vaisseaux sanguins dans les tissus fonctionnels générés artificiellement ou organes transplantés est indispensable pour une application clinique réussie.

Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les mécanismes exacts impliqués dans la vascularisation de plus en plus d'avoir un aperçu plus profond dans des situations pathologiques afin de trouver de nouvelles interventions thérapeutiques et de fournir une meilleure prévention des troubles vasculaires. Dans la première étape, les procédés de base tels que les interactions cellule-cellule ou l'effet de molécules sur les cellules du système vasculaire sont généralement étudiés en 2D ou en 3D in vitroexpériences. Les modèles traditionnels 2D sont faciles à réaliser, sont bien établis et ont grandement contribué à une meilleure compréhension de ces processus. Pour la première fois en 1980, Folkman et al. rapporté angiogenèse in vitro l' ensemencement de cellules endothéliales capillaires sur des plaques revêtues de gélatine ^1. Cela a immédiatement cédé la place à la publication d'une multitude d'autres expériences 2D de l' angiogenèse sur le tube de cellules endothéliales formation test ^2, la migration test ³ et la co-culture de différents types de cellules ^4, ainsi que d' autres. Ces essais sont encore utilisés aujourd'hui et acceptées comme standard dans les méthodes in vitro.

Cependant, cette configuration expérimentale est pas toujours approprié pour l'étude du comportement in vivo de cellules puisque la plupart des types de cellules ont besoin d' un environnement 3D pour former des structures physiologiques pertinentes des tissus ^5. On a pu montrer que l'architecture de la matrice 3D est déterminante pour capillaire morphogenesis ⁶ et que la matrice cellulaire (ECM) interactions cellulaires-extra et la culture 3D conditions régissent les facteurs importants impliqués dans l' angiogenèse tumorale ^7. La matrice 3D fournit des entrées mécaniques complexes, peuvent lier des protéines effectrices et établir des tissus à l'échelle des gradients de concentration de soluté. En outre, il est jugé nécessaire afin d'imiter en morphogénétique vivo et étapes de remodelage dans les tissus complexes ^5. Dans ces systèmes, à la fois l'angiogenèse et la vasculogenèse peuvent être étudiés. Alors que l' angiogenèse décrit le bourgeonnement des capillaires à partir de vaisseaux sanguins préexistants ^8, vasculogenèse se réfère à la formation de novo des vaisseaux sanguins par les cellules endothéliales ou leurs progéniteurs ^9,10. Maturation des navires est décrite dans un processus appelé «artériogenèse» via le recrutement de cellules musculaires lisses ^11. Un angiogénique typique modèle in vitro est le bourgeonnement des cellules endothéliales de monocouche existantess ensemencée en monocouche sur une surface de gel, sur la surface des microsphères noyées dans un gel ou en construisant des sphéroïdes de cellules endothéliales ^12. Dans les modèles vasculogéniques cellules endothéliales simples sont piégés dans un gel 3D. Ils interagissent avec les cellules endothéliales adjacentes pour former des structures et des réseaux de novo vasculaires, généralement en combinaison avec des cellules de soutien ^12.

Cependant, même en 3D complexes modèles in vitro ne peuvent pas imiter dans les paramètres in vivo complètement donné la multitude de cellule-cellule et cellule-ECM Interactions ^13. Les substances ayant une forte activité in vitro ne montrent pas automatiquement les mêmes effets in vivo et vice versa ^14. Pour une analyse complète de la vascularisation traite il y a un besoin urgent de développer des modèles in vivo que mieux simuler la situation dans le corps. Une large gamme d'essais in vivo de l' angiogenèse sont décrits dans la littérature, y compris lapoussin test chorio membranaire (CAM), le modèle zebrafish, le dosage de l' angiogenèse de la cornée, le modèle de sac d'air dorsal, la chambre dorsale du pli cutané, les modèles de tumeurs sous – cutanées ^14. Cependant, ces tests sont souvent associés à des limitations, telles que des changements morphologiques rapides, des problèmes dans de nouveaux capillaires distinctifs de ceux qui existent déjà dans l'essai de CAM, ou l'espace limité dans le dosage de l' angiogenèse cornéenne ^15. En outre, les systèmes non-mammifères sont utilisés (par exemple., Le modèle zebrafish ^16), ce qui conduit à des problèmes dans la xénotransplantation ^17. Dans le modèle de tumeur sous-cutanée, l'angiogenèse provenant uniquement de la tumeur elle-même ne peut être analysée puisque les tissus adjacents contribue fortement au processus de vascularisation. En outre, le tissu environnant peut avoir un rôle décisif dans la formation du microenvironnement de la tumeur ^18.

Non seulement pour l'étude de l'angiogenèse ou la vasculogenèse est-il une forte need pour un standard et bien caractérisé en ce modèle in vivo , mais également pour l' étude des différentes stratégies de vascularisation dans l' ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. De nos jours, la production d'organes ou de tissus artificiels complexes est possible à la fois in vitro et in vivo. Bioprinting 3D fournit une technique à la demande de fabrication pour la production 3D complexes tissus vivants fonctionnels ^19. En outre, les bioréacteurs peuvent être utilisés pour générer des tissus ²⁰ ou même le corps propre peut être utilisé comme bioréacteur ^21. Cependant, le principal obstacle à l'application réussie de tissus générés artificiellement est l'absence de vascularisation dans les constructions artificielles. Connexion immédiate à la vascularisation de l'hôte après la transplantation est une condition préalable importante pour la survie, en particulier dans le cas des tissus ou des organes artificiels à grande échelle.

In vitro ou différent dans les stratégies de prévascularisation vivo ont été déveau point pour établir une microvascularisation fonctionnelle dans des constructions avant l'implantation ^22. L'implantation d'un échafaudage avec des capillaires in vitro par génie préformées sur la peau dorsale de souris a conduit à une anastomose rapide du système vasculaire de la souris dans un ²³ jour. En revanche, une co-culture de sphéroïdes comprenant des cellules souches mésenchymateuses humaines et des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine assemblés en un réseau tridimensionnel prévasculaire développé davantage après implantation in vivo. Cependant, anastomose avec la vascularisation hôte a été limitée ^24. Surtout, des défauts mal vascularisés, comme les zones nécrotiques ou irradiés, cette soi-disant vascularisation extrinsèque – la croissance de vaisseaux de la région environnante dans l'échafaudage – échoue souvent. Vascularisation intrinsèque, d'autre part, est situé sur un axe vasculaire en tant que source de nouveaux capillaires poussent dans l'échafaudage ^25. En utilisant l'approche de la vascularisation axiale, L'ingénierie tissulaire peut être transplanté avec son axe vasculaire et relié aux navires locaux sur le site destinataire. Immédiatement après la transplantation, le tissu est suffisamment pris en charge par l'oxygène et de nutriments, ce qui crée les conditions d'une intégration optimale.

En raison de la disponibilité limitée des modèles d'enquête sur l' angiogenèse in vivo et dans la reconnaissance de l'importance croissante de générer des tissus axialement vascularisé, nous avons développé l'approche microchirurgicale de Erol et Spira en outre pour générer un artérioveineuse (AV) boucle dans le modèle animal ^26. L'utilisation d'une chambre d'implantation complètement fermée rend ce procédé très bien adapté pour étudier la formation des vaisseaux sanguins sous "contrôlée", bien caractérisés dans des conditions in vivo (figure 1). Ce modèle est non seulement utile pour l'étude de l'angiogenèse, mais est également parfaitement adaptée pour la vascularisation axiale de échafauds pour engin de tissudes fins ingé-.

Protocol

Le Comité des soins aux animaux de l'Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nuremberg (FAU) et le gouvernement du Moyen-Franconie, Allemagne, a approuvé toutes les expériences. Pour les expériences, des rats Lewis mâles avec un poids corporel de 300-350 g ont été utilisés. 1. La artério boucle Modèle dans le Rat Implantation Procédure (Figure 2) Pour l' anesthésie utiliser une boîte en plastique spécial qui est relié par un tube au vapo…

Representative Results

Création de tissus À des fins d'ingénierie du tissu osseux, un certain nombre de substituts osseux ont été implantés dans le petit animal de rat modèle de boucle AV 27,28,33,34. Vascularisation pourrait parfaitement être démontrée en 3D micro-tomographie par ordinateur (micro-CT) (figure 3A). Vascularisation d'une matrice bovine traitée os spongieux (PBCB) était significativement plus élevée dans le groupe de la bo…

Discussion

Depuis plus d' une décennie, nous avons utilisé avec succès l'artérioveineuse (AV) boucle à des fins d'ingénierie tissulaire et de l' angiogenèse étude in vivo dans le modèle des petits animaux. Nous pourrions démontrer que ce modèle microchirurgicale est très bien adapté pour l'ingénierie des tissus différents et qu'il peut également être utilisé pour les études de l'angiogenèse ou antiangiogéniques.

Importance de la techniqu…

Materials

0.9% sodium chloride	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / polypropylene	Ethicon	8695H
aluminium spray	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
antiseptics	BODE Chemie GmbH
Catheter	B Braun Meslungen AG	4251612-02
contrast agent	Flowtech	MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution	Intervet International GmbH
encre de chine intense indian ink	Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin	Bayer AG
eye ointment	Bayer AG
Formalin 4 %	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
Heparin	Ratiopharm GmbH
isoflurane	Abbott Laboratories	6055482
Lewis rat, male	Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium	Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal	Grünenthal GmbH