Method Article

在小型动物模型的动静脉（AV）循环研究血管生成和血管组织工程

DOI:

10.3791/54676

⸱

November 2nd, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), 2Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, 3Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

In This Article

Summary

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我们描述了动静脉（AV）循环作为在一个孤立的和充分表征的环境在体内分析血管模型的生成一个显微方法。这种模式不仅对血管生成的调查是有用的，但也最适合用于工程轴向血管化和移植的组织。

Abstract

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功能性血管网络是人体几乎所有组织和器官生存和生长的前提。此外，在癌症等病理情况下，血管形成在疾病进展中起主导作用。因此，迫切需要一个标准化且特征明确的体内模型，以阐明新生血管形成的机制并为组织工程和再生医学开发不同的血管化方法。

我们描述了一种用于小动物模型的显微外科手术方法，用于诱导由与动静脉 （AV） 环吻合的静脉和动脉组成的血管轴。AV 环被转移到封闭的植入室，以在体内形成一个孤立的微环境，该微环境仅通过血管轴与生物体相连。使用 3D 成像（MRI、micro-CT）和免疫组织学，可以随着时间的推移可视化不断增长的脉管系统。通过植入不同的细胞、生长因子和基质，可以在可控的环境中分析它们在血管网络形成中的功能，而不会受到周围环境的任何干扰影响。

除了血管生成和抗血管生成研究外，AV 环模型也非常适合工程化血管化组织。经过一定的血管前化时间后，生成的组织可以移植到缺损部位并通过显微外科连接到局部血管，从而确保立即供血和工程组织的整合。通过改变基质、细胞、生长因子和腔室结构，可以生成各种组织，然后可以根据个体患者的需要进行定制。

Introduction

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大多数组织和器官在人体内是依赖供给营养物质，交换气体和除去废产物的官能血管网络。该系统所造成的局部或全身血管问题的故障可能导致严重的疾病，众说纷纭。此外，在研究领域，如组织工程和再生医学，人工产生的组织或器官移植中的功能性血管网络是成功的临床应用是必不可少的。

数十年的研究人员一直在调查参与生长脉管获得，以便找到新的治疗干预，并提供更好的预防血管疾病的更深入的了解病理情况的确切机制。在第一步骤中，如细胞-细胞相互作用或分子的血管系统的细胞的作用基本过程通过体外 2D或3D通常调查实验。传统的二维模型很容易执行，已经非常成熟，并已大大更好地理解这些过程做出了贡献。对于在1980年第一次，Folkman 等 。报道在明胶涂层板1毛细血管内皮细胞体外血管生成播种。这立即让位给对内皮细胞管形成测定2，迁移试验3和不同细胞类型4的共培养进一步2D血管生成的实验，以及其他众多的出版物。这些试验至今仍在使用，并接受体外方法标准中。

然而，该实验装置并不总是适合于体内细胞行为的研究，因为大多数的细胞类型需要3D环境，以形成相关的生理组织结构5。它可以表明3D矩阵的结构是决定性的毛细管morphogenesi第6<....

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Protocol

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埃尔兰根 - 纽伦堡的弗里德里希 - 亚历山大大学的动物护理委员会（FAU）和中弗兰肯的政府，德国，批准所有的实验。对于实验，雄性Lewis大鼠体重为300 - 被用来350克。

1.动静脉循环模型大鼠

  1. 注入步骤（图2）
    1. 麻醉使用通过管道连接到异氟醚蒸发和盖子封闭一种特殊的塑料盒。打开供给气体和0.8之间流量计 - 1.5升/分。
    2. 放置在感应塑料盒大鼠和密封的顶部。打开异氟烷蒸发器至5％。
    3. 麻醉诱导时仔细观察大鼠。 3后 - 4分钟，大鼠将被麻醉。
    4. 确认正确的麻醉:翻正反射，眼睑反射消失，停药反射，角膜正反射消失。
    5. 从包装盒中取出老鼠并检查其权重的计算药物。应用眼膏，以防止干燥，而在麻醉下。
    6. 管理止痛药和抗生素（ 例如 ，7.5毫克/千克恩诺沙星皮下（SC），12.5毫克/千克曲马多和100mg / kg的安乃近两个静脉内（ⅳ））。操作期间管理重适于晶体溶液（ 例如 ，30毫升/千克SC）。
    7. 放置老鼠上加温板，在37℃麻醉下用1背面- 经由掩模施用2％异氟醚吸入。
    8. 监测麻醉适当，增加异氟烷如果麻醉水平太低（大鼠的运动，响应于疼痛，颚音调，无反射消失（见1.1.4。），心脏的速度增加）。要小心，不要过量异氟醚（角膜反射，高心脏率，氧饱和度下降的损失....

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Results

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组织工程
骨组织工程的目的，许多不同的骨替代，在小动物大鼠AV环模型27,28,33,34植入。血管可以完全由3D显微计算机断层摄影术（微CT）（ 图3A）来证明。经处理的牛松质骨（PBCB）矩阵的血管形成是环基中显著高于与没有血管的组。不断增长，maturating血管网8周以上的注入室之内的发展。 4和8周之间，观察到朝向构建体的中心的血管化组织的持续增长，而非血管组33中检测没有增加。在AV环模型的PBCB矩阵6周的Prevascularization导致注入的成骨细胞的优越存活与对照相比，成骨细胞。与此相反的对照组，植入骨细胞28在AV环组中检测到的骨特异性基因的表达。作为进一步的矩阵，烧结生物活性玻璃纤维蛋白凝胶一起在大鼠的AV环被植入。 3周后，新形成的血管的密集网络已发展成通过微CT和组织学27证实。

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Discussion

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十多年来，我们已成功地用于动静脉（AV）用于组织工程目的， 在体内循环，研究血管生成的小动物模型。我们可以证明这种显微模型是非常适合于工程不同组织，它也可以用于血管发生或抗血管生成的研究。

关于到现有/替代方法的技术意义
工程组织或器官需要的功能血管网络来提供他们所需要移植到缺损部位41后，他们的生存和成功整合的营养和氧气。许多不同的prevascularization策略已经发展了几十年来，它可以根据在体外与体内和外在与固有的方法区别开来。

支架可工房泰德与管形结构和血管细胞如体外42内皮细胞或祖细胞接种。另一方面，对于在体内 prevascularization，支架在一高度血管区域注入例如皮下或肌肉组织21。之后，这些外在血管构建体可被移植到缺损部位。然而，这些方法的缺点是缺乏移植后用收件人的血管显微连.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢以下机构支持我们的AV循环的研究:施德楼基金会，弗里茨Erler博士全宗，否则克朗Fesenius基金会，百特医疗用品有限公司，东风集团，IZKF / ELAN / EFI /性别办公室和多样性的Forschungsstiftung MEDIZIN ，埃尔兰根 - 纽伦堡（FAU），AO基金会，曼弗雷德·罗斯基金会，薛虹，汉斯格奥尔格盖斯基金会，德意志学术Austauschdienst（DAAD），德国和高等教育部和科研，伊拉克的弗里德里希 - 亚历山大大学。我们要感谢斯特凡·弗莱舍，滨海米尔德，卡特琳·科恩和伊尔莎·阿诺德Herberth的出色的技术支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% 氯化钠Berlin-Chemie AG34592508
11-0 乙硅隆 / 聚酰胺 6/6EthiconEH7438G
4-0 薇乔线 / 聚半乳糖 910EthiconV392H
6-0 Prolene / 聚丙烯Ethicon8695H
铝喷雾制药合作伙伴 Vertriebs-GmbH1020
防腐剂 BODE Chemie GmbH 公司 
导管 B Braun Meslungen AG4251612-02
造影剂Flowtech MV-122
恩布特胺、碘化甲贝佐铵、盐酸丁卡因注射液 Intervet International GmbH
encre de chine 浓郁印度墨水Lefranc &资产阶级
恩诺沙星Bayer AG
眼膏Bayer AG
福尔马林 4%Carl Roth GmbH & Co. KGP087.4
肝素Ratiopharm GmbH
异氟醚 雅培实验室6055482
刘易斯大鼠，雄性Charles River Laboratories
安他米唑-钠Ratiopharm GmbH
罂粟碱 / Paveron NLinden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / TramalGrünenthal GmbH 公司
剂

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Folkman, J., Haudenschild, C. Angiogenesis in vitro. Nature. 288 (5791), 551-556 (1980).
  2. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  3. Puddu, A., Sanguineti, R., Traverso, C. E., Viviani, G. L., Nicolo, ....

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