El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

Summary

Se describe un enfoque microquirúrgico para la generación de un bucle arteriovenosa (AV) como un modelo para el análisis de la vascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también es adecuado de manera óptima para la ingeniería vascularizado axialmente y tejidos trasplantables.

Abstract

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient’s needs.

Introduction

La mayoría de los tejidos y órganos del cuerpo humano dependen de una red de vasos sanguíneos funcionales que suministra nutrientes, intercambia los gases y elimina los productos de desecho. Mal funcionamiento de este sistema debido a los problemas vasculares locales o sistémicos puede conducir a una multitud de enfermedades graves. Por otra parte, en las áreas de investigación, como la ingeniería de tejidos o la medicina regenerativa, una red de vasos sanguíneos funcionales dentro de los tejidos generados artificialmente u órganos trasplantados es indispensable para el éxito de la aplicación clínica.

Durante décadas los investigadores han estado investigando los mecanismos exactos involucrados en la creciente vasculatura para ganar la penetración más profunda en situaciones patológicas con el fin de encontrar nuevas intervenciones terapéuticas y proporcionar una mejor prevención de trastornos vasculares. En el primer paso, los procesos básicos tales como las interacciones célula-célula o el efecto de moléculas sobre las células del sistema vascular son generalmente investigados por vitro en 2D o 3Dexperimentos. modelos 2D tradicionales son fáciles de realizar, están bien establecidos y han contribuido en gran medida a una mejor comprensión de estos procesos. Por primera vez en 1980, Folkman et al. reportado en la siembra de la angiogénesis in vitro de células endoteliales capilares en placas revestidas de gelatina ^1. Esto inmediatamente dio lugar a la publicación de una multitud de otros experimentos de angiogénesis 2D en tubo de ensayo de células endoteliales formación ^2, ensayo de migración de ³ y el co-cultivo de diferentes tipos de células ^4, así como otros. Estos ensayos se siguen utilizando hoy en día y se aceptan como estándar en métodos in vitro.

Sin embargo, esta configuración experimental no siempre es adecuada para el estudio del comportamiento de células in vivo ya que la mayoría tipos de células requieren un entorno 3D para formar estructuras de tejidos fisiológicos relevantes ^5. Se pudo demostrar que la arquitectura de la matriz 3D es decisivo para morphogenesi capilars ⁶ y que las interacciones célula-matriz celular adicional (ECM) y la cultura 3D condiciones regulan factores importantes que intervienen en la angiogénesis tumoral ^7. La matriz 3D proporciona entradas mecánicas complejas, pueden unirse a las proteínas efectoras y establecer gradientes de concentración de solutos tejido escala. Por otra parte, se considera necesario con el fin de imitar en morfogenética vivo y pasos de remodelación de tejidos complejos ^5. En estos sistemas, tanto la angiogénesis como la vasculogénesis puede ser estudiado. Mientras que la angiogénesis se describe el surgimiento de capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes ^8, vasculogénesis se refiere a la formación de novo de vasos sanguíneos a través de células endoteliales o sus progenitores ^9,10. La maduración de los vasos se describe en un proceso llamado "arteriogénesis" a través de reclutamiento de células de músculo liso ^11. Un angiogénico típico modelo in vitro es el surgimiento de células endoteliales de la monocapa existentes sembró como una monocapa en las superficies de gel, en la superficie de las microesferas incrustadas dentro de un gel o mediante la construcción de esferoides de células endoteliales ^12. En los modelos vasculogénicos células endoteliales individuales están atrapados en un gel 3D. Ellos interactúan con las células endoteliales adyacentes para formar estructuras y redes de novo vasculares, típicamente en combinación con células de apoyo ^12.

Sin embargo, incluso en 3D compleja en modelos in vitro no pueden imitar en entornos in vivo dado completamente la multitud de célula-célula y célula-ECM Interacciones de ^13. Las sustancias con alta actividad in vitro no muestran automáticamente los mismos efectos in vivo y viceversa ^14. Para un análisis exhaustivo de la vascularización procesa existe una necesidad urgente de desarrollar in vivo en modelos que simulan mejor la situación en el cuerpo. Una amplia gama de ensayos de angiogénesis in vivo se describen en la literatura, incluyendo elensayo polluelo corioalantoidea membrana (CAM), el modelo de pez cebra, el ensayo de angiogénesis de la córnea, el modelo de saco de aire dorsal, la cámara dorsal del pliegue cutáneo, los modelos de tumores subcutáneos ^14. Sin embargo, estos ensayos se asocian a menudo con limitaciones, tales como cambios morfológicos rápidos, problemas en nuevos capilares distintivas de las ya existentes en el ensayo de CAM, o el espacio limitado en el ensayo de angiogénesis de la córnea ^15. Además, se utilizan sistemas de no mamíferos (por ejemplo., El modelo de pez cebra ^16), que conduce a problemas en los xenotrasplantes ^17. En el modelo de tumor subcutáneo, la angiogénesis se origina sólo a partir del propio tumor no puede ser analizada desde el tejido adyacente contribuye en gran medida al proceso de vascularización. Por otra parte, el tejido circundante puede tener un papel decisivo en la formación del microambiente tumoral ^18.

No sólo para el estudio de la angiogénesis o vasculogénesis es que hay una fuerte need para una estandarizado y bien caracterizado modelo in vivo, sino también para el estudio de diferentes estrategias de vascularización en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Hoy en día, la generación de órganos artificiales complejos o tejidos es posible tanto in vitro como in vivo. Bioprinting 3D proporciona una técnica de fabricación bajo demanda para la generación de complejo 3D tejidos vivos funcional ^19. Además, los biorreactores se pueden utilizar para la generación de tejidos ^{de 20} o incluso el propio cuerpo puede ser utilizado como biorreactor ^21. Sin embargo, el principal obstáculo para la aplicación exitosa de los tejidos generados artificialmente es la falta de vascularización dentro de las construcciones de ingeniería. Conexión inmediata a la vasculatura del huésped tras el trasplante es un requisito previo importante para la supervivencia, especialmente en el caso de tejidos u órganos artificiales de gran escala.

Diferentes estrategias in vitro o in vivo en prevascularization eran desadesa- para establecer una microvasculatura funcional en construcciones antes de la implantación ^22. La implantación de un andamio con in vitro capilares ingeniería preformadas sobre la piel dorsal de ratones condujo a una rápida anastomosis de la vasculatura ratones dentro de un día ^23. En contraste, un co-cultivo de esferoides que consiste en células madre mesenquimatosas humanas y células endoteliales de la vena umbilical humana reunidos en una red prevascular tridimensional desarrolló aún más después de la implantación in vivo. Sin embargo, la anastomosis con la vasculatura huésped se limitó ^24. Por encima de todo, en los defectos pobremente vascularizados, como las áreas necróticas o irradiados, esta llamada vascularización extrínseca – el crecimiento interno de los vasos de la zona circundante en el andamio – a menudo falla. Vascularización intrínseca, por el contrario, se basa en un eje vascular como fuente de nuevos capilares que brotan en el armazón ^25. Utilizando el enfoque de la vascularización axial, La ingeniería tisular puede ser trasplantado con su eje vasculares y conectado a los vasos locales en el sitio receptor. Inmediatamente después del trasplante, el tejido está adecuadamente soportada por el oxígeno y los nutrientes, lo que crea las condiciones adecuadas para la integración óptima.

Debido a la limitada disponibilidad de modelos para la investigación de la angiogénesis in vivo y en reconocimiento de la creciente importancia de generar tejido vascularizado axialmente, hemos desarrollado el enfoque microquirúrgico de Erol y Spira además para generar un bucle arteriovenosa (AV) en el modelo animal ^26. El uso de una cámara de implantación completamente cerrada hace que este método muy adecuado para estudiar la formación de los vasos sanguíneos debajo de "controlado", bien caracterizado en condiciones in vivo (Figura 1). Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también se adapta de forma óptima para la vascularización axial de los andamios de tejido Engininge- propósitos.

Protocol

El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg (FAU) y el Gobierno de Franconia Media, Alemania, aprobó todos los experimentos. Para los experimentos, las ratas Lewis macho con un peso corporal de 300 – 350 g se utilizaron. 1. El modelo de bucle arteriovenosa en la rata Procedimiento de implantación (Figura 2) Para la anestesia utilizar una caja de plástico especial que está conectado a través del tubo al vaporizado…

Representative Results

Ingeniería de tejidos Para los propósitos de ingeniería de tejido óseo, un número de diferentes sustitutos de hueso se implanta en el intestino de rata de animales modelo de bucle AV 27,28,33,34. Vascularización perfectamente pudo demostrarse por 3D tomografía micro-computarizada (micro-CT) (Figura 3A). La vascularización de una matriz procesada bovina hueso esponjoso (PBCB) fue significativamente mayor en el grupo de bucle en c…

Discussion

Desde hace más de una década, se ha utilizado con éxito el asa arteriovenosa (AV) para propósitos de ingeniería tisular y la angiogénesis estudiar in vivo en el modelo animal pequeño. Hemos podido demostrar que este modelo de microcirugía se adapta muy bien para la ingeniería de tejidos diferentes y que también se puede utilizar para los estudios de la angiogénesis o antiangiogénico.

Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes</str…

Materials

0.9% sodium chloride	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / polypropylene	Ethicon	8695H
aluminium spray	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
antiseptics	BODE Chemie GmbH
Catheter	B Braun Meslungen AG	4251612-02
contrast agent	Flowtech	MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution	Intervet International GmbH
encre de chine intense indian ink	Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin	Bayer AG
eye ointment	Bayer AG
Formalin 4 %	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
Heparin	Ratiopharm GmbH
isoflurane	Abbott Laboratories	6055482
Lewis rat, male	Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium	Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal	Grünenthal GmbH