Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel<em> Drosophila</em

Summary

Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.

Abstract

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

Introduction

Drosophila melanogaster è stato utilizzato per più di un secolo nello studio della genetica e di altre questioni biologiche fondamentali. Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che la Drosophila è un potente strumento per lo studio di molte malattie umane. Il 70 – 80% di geni associati a malattie umane hanno una mosca ortologo identificata ^{1 – 4,} Drosophila fornisce un sistema semplificato ma traducibile in cui studiare le malattie complesse. Il metabolismo, in particolare, ha beneficiato di tale studio. Non solo la genetica del metabolismo ben conservati tra le mosche e gli esseri umani, ma gli organi competenti e tipi di cellule sono molto simili ^{a 2,5.} Ad esempio, il grasso corporeo dei negozi mosca entrambi Triacilgliceroli (TAG) e di glicogeno, funzioni analoghe a quelle svolte nel fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo bianco ^6. Utilizzando Drosophila come modello per l'obesità umana ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di lipidiil metabolismo e la genetica di obesità ^7. Lo stadio larvale di sviluppo è particolarmente utile per studiare la segregazione di nutrienti stoccaggio o utilizzo come è dedicata all'alimentazione e l'immagazzinamento di energia da utilizzare durante pupariation.

Attualmente, ci sono molti metodi quantitativi diversi della determinazione dei livelli di stoccaggio dei grassi in Drosophila. Il metodo più diffuso è il saggio colorimetrico accoppiato (CCA) ^8,9. CCA è stato sviluppato per determinare i livelli TAG nel siero umano e opera sulla premessa che glicerolo liberato dalla spina dorsale di trigliceridi subirà diverse reazioni, che si traduce in una reazione redox-coupled generando un prodotto colorato. Assorbanza di specifiche lunghezze d'onda di luce viene poi misurata per determinare la quantità iniziale di glicerolo presente. Tuttavia, glicerolo può anche essere liberato da mono- e diacylglycerides oltre al TAG e quindi non può essere una misura accurata di storato grasso corporeo ^9. Inoltre, l'occhio del pigmento di mosche adulte schiacciati può interferire con alcune letture di assorbanza e complicare i risultati ^9,10. Pertanto, CCA deve essere accompagnato e convalidato cromatografia su strato sottile (TLC), che permette la separazione delle maggior parte delle famiglie di lipidi che può essere quantificata mediante densitometria ^10,11. Tuttavia, alcune classi di lipidi, come steroli non possono essere analizzati e devono essere quantificati un modo diverso ^12. La spettrometria di massa (MS) è un modo preciso per quantificare tutte le classi di grandi lipidi cellulari ^12,13. Tuttavia, le procedure di estrazione dei lipidi necessari per analizzare da MS sono sia in termini di tempo (più presa quasi un giorno intero) e costosa. Qui vi presentiamo un metodo alternativo per determinare rapidamente ed economicamente livelli di grasso organismal nelle larve L3 di Drosophila melanogaster.

Il metodo presentato sotto sfrutta la differenza di densità tra tessuto adiposo e tessuto magro. fa mammiferit tessuto ha una densità di circa 0,9 g / ml ¹⁴ mentre il muscolo scheletrico come una densità di 1,06 g / ml ^15. Questa differenza significa che gli animali con elevate riserve di grasso avranno densità inferiore rispetto agli animali con i negozi più bassi di grasso, che permetteranno loro di galleggiare meglio in una soluzione della densità fisso. Questa proprietà consente estremamente rapido lo screening di un gran numero di animali pur essendo sia poco costoso e non invasivo. Analisi di galleggiabilità-based è stato utilizzato sia per confermare i fenotipi di alterare regolatori noti di livelli di grasso, nonché di individuare nuovi regolatori genetici e neurologici di obesità ^16,17.

Protocol

1. raccogliere le uova dalle mosche con genotipi di interesse NOTA: croci ideali sono costituite da 150 mosche vergini e almeno 75 maschi. collezioni di archivio deve essere composto da almeno 200 mosche. Preparare piatti d'uva. Aggiungere 37,5 g di agar a 1,5 L di acqua distillata in un matraccio 4 L. Autoclave miscela acqua / agar per 50 min a 121 ° C (250 ° F). Mentre l'acqua / miscela agar è autoclave, aggiungere 50 g di saccarosio al succo d'uva da 500 …

Representative Results

La figura 1 rappresenta un esempio di come il dosaggio galleggiamento-based può rilevare sia depositi grassi superiori e inferiori in larve geneticamente manipolati. La figura 1A mostra che eccitazione o silenziamento di un certo sottoinsieme di neuroni (E347) nel cervello larvale induce grassi inferiori e superiori negozi rispettivamente. Lo stesso controllo background genetico è stato utilizzato in entrambi i casi. Figura 1B fornisce…

Discussion

Ci sono una moltitudine di tecniche che sono state sviluppate per misurare i livelli di lipidi ^{8 – 10.} Tuttavia, ciascuno di questi metodi viene fornito con alcuni importanti inconvenienti che sono indirizzati mediante il saggio galleggiamento basato descritto sopra. In primo luogo, questo test è estremamente rapido. Test di un gradiente di piena concentrazione non richiede più di 30 – 60 min. Questo è un enorme miglioramento sulla maggior parte delle tecniche attualmente in uso. Ad e…

Materials

Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50mL Conical	Fisher	50-869-569