Плавучесть на основе метод определения жира в<em> Drosophila</em
Summary
Здесь мы представляем метод измерения организменном уровни жира в третьей возрастной стадии (L3) личиночной стадии дрозофилы. Этот метод использует сравнительно низкую плотность жировой ткани, чтобы различать личинок с измененными жировых запасов. Плавучести на основе анализа является ценным инструментом для быстрой, воспроизводимой и экономичного скрининга.
Abstract
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Introduction
Дрозофилы был использован на протяжении более ста лет в изучении генетики и других основных биологических вопросов. За последние несколько десятилетий, стало ясно , что дрозофила является мощным инструментом в изучении многих заболеваний человека. В 70 – 80% генов , связанных с заболеваниями человека имеют идентифицированного муха ортолог 1 – 4, дрозофила обеспечивает упрощенную еще переводимый систему , в которой для изучения сложных заболеваний. Метаболизм в частности, извлекли выгоду из такого исследования. Мало того, что генетика метаболизма хорошо сохраняющиеся между мух и людей, но соответствующие органы и типы клеток также очень похожи 2,5. Например, жировое тело мухи магазинах оба триацилглицериды (TAG) и гликоген, функции , аналогичные тем , которые выполняются в печени млекопитающих и белой жировой ткани 6. Использование дрозофилы в качестве модели для человеческого ожирения значительно улучшилось наше понимание липидаметаболизм и генетика ожирения 7. Личиночной стадии развития является особенно полезным для изучения сегрегации питательных веществ при хранении или утилизации, как он предназначен для подачи и хранения энергии, которые будут использоваться во время pupariation.
В настоящее время существует множество различных количественных методов определения уровней хранения жира у дрозофилы. Наиболее широко используемый метод в сочетании колориметрический анализ (ССА) 8,9. ОАС был разработан для определения уровней TAG в сыворотке крови человека и работает на предпосылке, что глицерол, освобожденной от основной цепи триглицеридов претерпит несколько реакций, в конечном счете, в результате чего в окислительно-восстановительной реакции в сочетании генерирующего окрашенного продукта. Абсорбция конкретных длин волн света, затем измеряют для определения первоначального количества глицерина настоящего. Тем не менее, глицерин также может быть освобожден от моно- и диацилглицеридов в дополнение к TAG и, следовательно, не может быть точным показателем сключена жир тела 9. Кроме того, глаз пигмент измельченных взрослых мух может помешать некоторым значений оптической плотности и усложняют результаты 9,10. Таким образом, ССА должно сопровождаться и проверены с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), что позволяет для разделения большинства липидных семей , которые могут быть количественно с помощью денситометрии 10,11. Тем не менее, некоторые липидные классы , как стерины не могут быть проанализированы и должны быть количественно иным способом 12. Масс – спектрометрия (МС) является точным способом количественной оценки всех классов основных клеточных липидов 12,13. Тем не менее, процедуры экстракции липидов, необходимые для анализа с помощью МС являются как много времени (больше всего брать почти весь день) и дорогостоящим. Здесь мы представляем альтернативный способ быстро и дешево определять уровни организменном жира у личинок L3 дрозофилы.
Метод, представленный ниже, использует разницу в плотности между жировой ткани и нежирной ткани. млекопитающим Ф.А.т ткань имеет плотность примерно 0,9 г / мл 14 в то время как в скелетных мышцах как плотность 1,06 г / мл 15. Эта разница означает, что животные с более высокими запасами жира будет иметь меньшую плотность, чем у животных с более низкими запасами жира, что позволит им лучше плавать в растворе фиксированной плотности. Это свойство позволяет чрезвычайно быстро скрининга большого количества животных, в то же время как недорогой и неинвазивные. Плавучести на основе анализа был использован как для подтверждения фенотипы изменения известных регуляторов жировых уровней, а также для выявления новых генетических и неврологических регуляторов ожирения 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть множество методов , которые были разработаны для измерения уровней липидов в 8 – 10. Тем не менее, каждый из этих методов идет с некоторыми существенными недостатками, которые решаются с помощью анализа плавучести на основе описанной выше. Во-первых, этот анализ явл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Materials
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
- Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
- Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
- Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
- Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).
- Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
- Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
- Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).
- Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
- Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
- Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
- Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
- Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
- Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
- Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).
- Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
