HIV-1感染細胞からのエキソソームのSILACベースのプロテオミクス特性評価
Summary
ここでは、ホストエキソソームプロテオームのHIV-1感染の効果を分析するために、細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識法（SILAC）を用いて定量的プロテオミクスの方法を記載します。このプロトコルは、容易に異なるストレスまたは感染の条件下で細胞に適合させることができます。
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
ウイルス感染を含む多くのヒトの疾患は、多くの場合、影響を受けた細胞とその周辺行われる独特の細胞プロセスに関連しています。タンパク質は、多くの場合、これらのプロセスを仲介する、究極の携帯エフェクターとして働きます。タンパク質の分析は、多くの場合、影響を受けた細胞の局所環境に関して貴重な情報を提供し、疾患の病因の根底にあるメカニズムを理解するために私たちを助けることができます。様々なタンパク質分析技術の中で、プロテオミクスは、特に非常に有望です。強力な、大規模なツールとして、プロテオミクスは、特に、タンパク質の機能および相互作用の領域において、細胞プロセスの全身的な理解を提供することができます。特定のタンパク質を分析して、調査のサイトにおいて、研究者は、細胞成分、特にタンパク質の発現をモニターすることを可能にする標識技術の開発により簡素化されます。多くのプロテオーム解析は、携帯で行われてきたがプロテオームスケール、細胞内コンパートメントにプロテオミクスの特徴付けは、1特に有益であることが判明しています。これは、HIV-1感染症の研究によく例示されています。
エキソソーム、細胞タイプ2、3の広い範囲によって分泌さ30〜100nmの膜小胞は、細胞間コミュニケーションと分子輸送の重要な構成要素です。これらは、以前にHIV-1出芽過程4、5で重要な役割を果たすことが発見されました。機能解剖とプロテオーム解析を組み合わせることにより、我々は、HIV-1感染細胞から放出されたエキソソームは、細胞のアポトーシスおよび増殖6を含む受容細胞を、隣接の細胞特性に影響を与えるユニークかつ定量的に異なるタンパク質の署名と港調節分子で構成されていることがわかりました。方法は、このプロトコルに記載されており、HIV-1感染細胞からのエキソソームの、すなわちSILAC（細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識）7ベースのプロテオミクス特性評価。同様のアプローチは、より良い目的の特定の区画または画分に実験的応力を調整し、記載された手順に必要な変更を行うことで、発病時に他の細胞内コンパートメントを理解するために適用することができます。
定量プロテオミクス法の最近の発展を考えると、特定の実験のために最も効率的な方法を選択するときに選択することが多くあります。これらのうち、化学ベースのiTRAQ（相対および絶対定量のための同重体タグ）8とラベルフリーMRM（多重反応モニタリング）9の技術があります。両方の方法は、強力なツールであり、特定の設定のために良い選択です。主に細胞株を操作典型的な研究室のために、しかし、これらの2つの方法は、relativelを有しますyの高いコストと多くの時間がかかるSILACベースの方法と比較しています。 SILACは、細胞タンパク質に培養培地からのアミノ酸の非放射性同位体形態を組み込んだ、代謝ベースの標識技術です。一般的に、SILAC実験は、例えば、感染および非感染、2つの細胞集団で始まります。完全な標識化が達成されるまで、それぞれが差動で、その特定の同位体の環境で標識されています。これらの細胞を標識したエキソソームを、次いでタンパク質抽出に供されます。一度抽出し、標識されたエキソソームのタンパク質は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法10を用いて分析します。最後に、質量分析結果と大幅に標識されたタンパク質は、同様に厳格な生化学的検証を分析し、統計的およびバイオインフォマティクスに供されます。我々の以前の調査レポートは、細胞株は、ANに通常あるようにSILAC /エキソソーム手順は、初代細胞よりも細胞系に適していることを示唆しています効率的な同位体標識のための積極的な増殖性状態、
Protocol
Representative Results
Discussion
このホワイトペーパーで説明する手順では、ホストエキソソームプロテオーム上のHIV-1感染の影響を調査するためにSILAC技術の適用を実証しました。最初に、未感染およびHIV-1感染細胞を示差同位体標識されています。差別的に標識されたエキソソームは、その後、タンパク質抽出を行う前に精製されます。次に、液体クロマトグラフィー – タンデム質量分析は、エキソソームのプロテオーム?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、BRに寿命/タフツ/ブラウンCFAR、P30AI042853-13S1、NIH P20GM103421、P01AA019072、R01HD072693、およびK24HD080539にARRAサプリメントによってサポートされていました。この作品は、また、寿命パイロット研究基金（＃701- 5857）、ロードアイランド州財団医学研究助成（＃20133969）、およびMLへNIH COBRE URI / RIHパイロット研究助成（P20GM104317）によってサポートされていました。私たちは、原稿や図形に関するお手伝いのためにジェームズ未開のとVyのダンに感謝します。
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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