Summary

HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

Published: March 03, 2017
doi:

Summary

Burada, ana exosomal proteomlarda HIV-1 enfeksiyonunun etkilerini analiz etmek için hücre kültürü (SILAC) amino asitler ile izotop etiketleme tekniği kullanılarak kantitatif proteomik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, kolayca farklı gerilme veya enfeksiyon koşullarda hücrelere uyarlanabilir.

Abstract

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introduction

viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere bir çok insan hastalıkları, sık sık etkilenen hücrelerin etrafında yer alan farklı hücresel süreçleri ile ilişkilidir. Proteinler, genellikle bu süreçleri arabuluculuk, nihai hücresel efektör olarak hareket. Proteinlerin analizi sıklıkla etkilenen hücrelerin yerel çevreye kadar çok değerli bilgiler sağlar ve hastalık patogenezinde altta yatan mekanizma anlamak için bize yardımcı olabilir. Çeşitli protein analiz teknikleri arasında, proteomik özellikle büyük umut vaat ediyor. güçlü, geniş çaplı bir aracı olarak, proteomik, özellikle fonksiyon ve protein etkileşim alanında, hücresel süreçlerin bir tarihsel sağlayabilir. Belirli proteinlerin analiz İnceleme bölgesinde, araştırmacılar, hücresel bileşenler, özellikle de proteinlerinin ekspresyonunu izlemek için izin etiketleme teknikleri geliştirilmesi yoluyla basit yapılır. Birçok proteomik analizler hücresel gerçekleştirilen olmasına rağmenproteom ölçeği, hücre içi bölmeleri üzerinde proteomik karakterizasyonu 1 özellikle bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştır. Bu HIV-1 enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda iyi örneklenmiştir.

Eksozomlar, hücre tipleri 2, 3, geniş bir yelpazede tarafından salgılanan 30-100 nm zar vezikülleri arası iletişim ve moleküler taşıma önemli bileşenleridir. Daha önce HIV-1 tomurcuklanma 4, 5 önemli roller oynamaya keşfedildi. Fonksiyonel diseksiyon ile proteomik analizi birleştirerek, HIV-1 ile enfekte hücrelerden salınan eksozomlar hücresel apoptoz ve çoğalması 6 olmak üzere alıcı hücreler, komşu hücresel özelliklerini etkileyecek eşsiz ve nicelik farklı protein imza ve liman düzenleyici moleküller oluşur bulundu. yöntemler bu protokolde tarif edilmiştir,yani SILAC HIV-1 enfekte hücreleri eksozom 7 göre proteomik karakterizasyonu (hücre kültürü içinde amino asitler ile izotop işaretleme). Benzer yaklaşımlar, daha özel bir bölme veya ilgi fraksiyonuna deneysel gerilme ayarlama ve tarif edilen prosedürlere, gerekli değişiklikler yaparak patojenez sırasında, diğer alt-hücresel bölümleri anlamak için uygulanabilir.

kantitatif proteomik yöntemlerin son gelişmeleri göz önüne alındığında, belirli bir deney için en etkili yöntem seçerken seçim için pek çok vardır. Bunlar arasında kimyasal bazlı iTRAQ (göreli ve mutlak ölçümü için izobarik etiketleri) 8 ve etiket içermeyen MRM (çoklu reaksiyon izleme) 9 teknikleridir. Her iki yöntem güçlü araçlardır ve özel ayarlar için iyi seçimlerdir. Tipik bir laboratuvar ağırlıklı hücre hatları ile çalışmak için, ancak, bu iki yöntem şansı göreceli vary yüksek maliyetler ve vardır daha zaman alıcı SILAC tabanlı yönteme göre. SILAC hücresel protein olarak kültür ortamından amino asit radyoaktif olmayan izotop formlarını içeren bir metabolik göre etiketleme tekniği. Tipik haliyle, SILAC deneyler, örneğin iki hücre popülasyonlarının, enfekte olan ve olmayan ile başlar. Tam etiketleme elde edilene kadar her diferansiyel kendine özgü izotopik ortamda etiketlenir. Bu hücrelerin etiketli eksozomlar sonra protein ekstre etmeye tabi tutulmaktadır. Bir kez etiketli exosomal proteinleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektroskopisi 10 kullanılarak analiz edilmektedir, ayıklanır. Son olarak, kütle spektrometresi sonuçları ve önemli ölçüde etiketli proteinler istatistiksel tabi tutulur ve biyoinformatik titiz biyokimyasal doğrulama yanı sıra analiz eder. Bizim daha önceki soruşturma raporları hücre hatları bir genellikle olduğu gibi SILAC / eksozom prosedürleri, birincil hücrelerden daha hücre hatları için daha uygun olacağı kanısındayızverimli izotop etiketleme için aktif prolifere devlet,

Protocol

1. Hücre Kültürü ve HIV-1 enfeksiyonu NOT: deneyler başlamadan önce, bir MTT testi 12 ile Tripan Mavisi boyaması 11 ile hücrelerin canlılığı ve çoğalmasını kontrol edilmesi tavsiye edilir. Aynı zamanda yeni hazırlanan SILAC ortamını kullanmak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli hücre çizgileri de aktif olarak çoğalma aşamasında olan ve HIV-1 enfeksiyonu, veya tercih test koşulu duyarlı olduğu sürece, kullanılabi…

Representative Results

Şekil 1A SILAC etiketleme prosedürü 21 gösteren bir akış şemasıdır. eksozomlar arındırmak için, numuneler santrifüj yoluyla döndürülür gerekir. Şekil 1B seri Ultrasantrifügasyon 21 exosome saflaştırma adımları göstermektedir. saflaştınldı sonra prosedür de tarif edilen, eksozomlar deney proteomik analize tabi tutulur. …

Discussion

Bu yazıda tarif edilen prosedürlere olarak, ana exosomal proteomu HIV-1 enfeksiyonunun etkisini araştırmak için SILAC tekniğin uygulanmasını göstermektedir. Başlangıçta, enfekte edilmemiş ve HIV-1 ile enfekte edilmiş hücreleri, farklı olarak, izotopla işaretli bulunmaktadır. farklı şekilde etiketlenmiş eksozomlar sonra protein çıkarma yapmadan önce saflaştırılır. Daha sonra, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi exosomal Proteomun analiz için kullanılır. Son olarak, elde edilen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma BR ömrü / Tufts / Kahverengi SYAO, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 ve K24HD080539 bir arra ek tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ömrü Pilot Araştırma Fonu (# 701- 5857), Rhode Island Vakfı Tıbbi Araştırma Grant (# 20133969), ve ML NIH COBRE URI / RİH Pilot Araştırma Grant (P20GM104317) tarafından desteklenmiştir. Biz el yazması ve şekil hazırlanması ile ilgili yardım için, James Myall ve Vy Dang teşekkür ederiz.

Materials

H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1NL4-3   NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000g
50mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Play Video

Cite This Article
Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

View Video