Summary

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) – ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לאסוף עכבר בתאי גזע עובריים (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) מן התנאים תרבות serum- ומזין ללא ולאפיין תפקודים ביולוגיים שלה.

באופן כללי, תאי גזע עובריים (ESCs) יש פוטנציאל גדול עבור רפואה רגנרטיבית וטיפול התא עקב מגוונת" ויכולתן עבור התחדשות עצמית 1-3. עם זאת, ההשתלה הישירה של תאי גזע יש מספר מגבלות, כגון דחייה חיסונית גידול היווצרות 4,5. לכן, גישת תא ללא עשויה לספק אסטרטגיה טיפולית חלופית עבור רפואת רגנרטיבית והתערבויות הזדקנות 6,7.

ההזדקנות נתפסת עמיתו הסלולר הזדקנות רקמות ואיברים, המאופיינת במצב מתמיד של מעצר צמיחה, פיזיולוגית תא שהשתנתה ולאחר התנהגויות. הזדקנות היא גרם הסיכון העיקרי למחלות נפוצות כולל הסרטן, מחלות לב וכלי דם, type 2 סוכרת, ניוון מוחיים 8. אחד המאפיינים הברורים של הזדקנות היא ירידת פוטנציאל ההתחדשות של רקמות, אשר נגרם על ידי הזדקנות תאי גזע ותשישות 9. מחקרים רבים הראו משמעותי מולקולות תרופתיות, כגון rapamycin 9, רזברטרול 10, ומטפורמין 11, וגורמים מערכתיים שמקורן בדם, כלומר GDF11 12, שיש להם את היכולת לעכב הזדקנות בעקביות להאריך את תוחלת חיים.

במחקר הנוכחי, המסקלין-CM נקצר ללא בסרום (בסרום שור עוברי, FBS) ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) שכבות כדי לשלול את הזיהום של גורמים בסרום וגורם הפרשה מן MEFs. תנאים אלה אפשרו CM serum- והמזין ללא ושכתוצאה מכך אפשר זיהוי המדויק של גורמי פרשת המסקלין ספציפיים.

פרוטוקול מוצע זה יעיל ביותר, יחסית חסכוני, וקללהפעיל. טכניקה זו מספקת תובנה על האפיון של גורמים מסיסים הנגזרות המסקלין שיכול לתווך אפקט אנטי-הזדקנות, אשר עשוי לשמש לפיתוח גישה טיפולית בטוחה יתרון פוטנציאלי ללא תא כלפי התערבויות למחל הזדקנות קשורה ומבריא אחר טיפולים.

Protocol

הערה: סכמטי של serum- ופרוטוקול אוסף מזין ללא CM מוצג באיור 1. 1. חומרים (הכנת MEFs, בינוני, צלחות, ופתרונות) הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת את MEFs. מוסף בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS (איכות…

Representative Results

במקור, mESCs נשמרות על מזין MEF במדיום המסקלין עם FBS ותוספי מזון אחרים (איורים 1 א ו 2 א). CM נאסף mESCs ב מופחתת מדיה סרום ללא שכבת מזין, FBS, או תוספי מזון אחרים (1B דמויות 2B). מצב התרבות זה מאפשר לנו לאסוף המסקלין ספציפי מותנה ב…

Discussion

עבור האוסף המוצלח של serum- ומזין ללא המסקלין-CM, את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. הגורם הקריטי ביותר הוא באמצעות mESCs הפרקים המוקדמים לאיסוף המסקלין-CM. בעבר, הוכח כי מוקדם מעבר המסקלין-CM יש השפעות אנטי אייג'ינג טוב יותר לעומת mESCs מעבר מאוחר. מספר חלוף mESCs דווח להשפיע …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי תכנית המחקר במדעי יסוד (2013R1A1A2060930) ותכנית המרכז למחקר הרפואית (2015R1A5A2009124) באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הממומן על ידי משרד המדע, ICT, ותכנון לעתיד. מחקר זה נתמך גם על ידי חברת סטארט-אפ הפעלה מענק מטעם בית החולים לילדים (HK סונג). ברצוננו להודות לורה Barwell ושרה JS קים לעזרה שלהם מעולה בעריכת כתב היד הזה וד"ר אנדרס Nagy למתן הקו G4 המסקלין.

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Play Video

Cite This Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

View Video