Summary

血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

このプロトコルは、マウス胚性幹細胞(MESC)を収集するための方法を提供するメディア-conditioned(MESC-CM)血清(ウシ胎児血清、FBS)に由来する – とフィーダー細胞のための(マウス胚線維芽細胞、MEFの)フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

このプロトコルの目的は、血清および無フィーダー培養条件から培地(MESC-CM)を-conditionedし、その生物学的機能を特徴づけるために、マウス胚性幹細胞(MESC)を収集することです。

一般的には、胚性幹細胞(ESCは)による自己再生1-3のための彼らの多能性と能力に再生医療や細胞治療のための大きな可能性を持っています。しかし、幹細胞の直接移植は、免疫拒絶および腫瘍形成4,5のようないくつかの制限を有します。従って、無細胞アプローチは、再生医療や老化介入6,7の代替治療戦略を提供することができます。

老化は、増殖停止、改変された細胞生理学、および行動の永続的な状態によって特徴付けられる組織や臓器の老化に対する細胞相手と見られています。老化、癌、心臓血管疾患、Tなどの流行病のための主要な危険因子であります2型糖尿病、および神経変性8を YPE。老化の明らかな特徴の一つは、幹細胞の老化や枯渇9によって引き起こされる組織の再生能力の低下、です。多くの重要な研究は、このような一貫して老化を遅らせ、寿命を延長する能力を持っているラパマイシン9、レスベラトロール10、およびメトホルミン11、および血液媒介全身の要因、すなわちGDF11 12、薬理学的分子を、示しています。

本研究では、MESC-CMは、血清因子とのMEFからの分泌因子の混入を排除するために、血清(ウシ胎児血清、FBS)およびフィーダー(マウス胚線維芽細胞、MEFの)層なしで収穫されています。これらの条件は、結果的にMESC固有の分泌因子の正確な同定を可能に血清および無フィーダーCMを可能にしました。

この提案されたプロトコルは、非常に効率的で比較的費用対効果、および容易動作します。この技術は、老化関連疾患及びその他の再生のための介入に向かって安全かつ潜在的に有利な無細胞治療アプローチの開発のために使用することができる抗老化効果を媒介することができるMESC由来の可溶性因子の特性への洞察を提供しますトリートメント。

Protocol

注:血清及び無フィーダーCM収集プロトコルの概略図を図1に示されています。 1.材料(MEFを、ミディアム、プレート、および溶液の調製) 文化のMEFに培地の500ミリリットルを準備します。 10%FBS(ESC品質)、50単位/ mlペニシリン、および50mg / mlストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を補足。 確立されたルーチンプロトコル13?…

Representative Results

もともと、たmESCは、FBSおよび他のサプリメント( 図1Aおよび2A)とのMESC培地中のMEFフィーダー上で維持されています。 CMは、フィーダー層、FBSまたは他のサプリメント( 図1Bおよび2B)なし低血清培地におけるたmESCから収集しました。この培養条件は、潜在的なフィーダからの要因による汚染、FBS、または他のサプ?…

Discussion

血清および無フィーダーMESC-CMの成功収集のために、以下の提案を考慮に入れなければなりません。最も重要な要因は、MESC-CMを収集するための初期継代たmESCを使用しています。以前は、初期継代MESC-CMは、後期継代たmESCと比較して、より良好なアンチエイジング効果を有することが示されています。たmESCの継代数は、それらの発生能16及び多能17に影響与えることが…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、基礎科学研究開発プログラム(2013R1A1A2060930)および医学研究センタープログラム(2015R1A5A2009124)韓国国立研究財団を通じて(NRF)、科学、ICT省が資金を提供し、今後の計画によってサポートされていました。この研究はまた、病気の子供のための病院からの起動オペレーティング・グラント(HK歌唱)でサポートされています。私たちは、G4 MESCラインを提供するために、この原稿博士アンドラーシュナジの編集中にその優れた助けのためのLaura BarwellとサラJSキムに感謝したいと思います。

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

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Cite This Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

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