Summary

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) – ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

Bu protokolün amacı, serum- ve besleyici içermeyen kültür koşullarından fareye embriyonik kök hücre (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) toplamak ve biyolojik fonksiyonları karakterize etmektir.

Genel olarak, embriyonik kök hücreler (EKH) nedeniyle kendini yenileme 1-3 onların pluripotensin ve kapasite rejeneratif tıp ve hücre tedavisinde büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, kök hücrelerin doğrudan nakli gibi bağışıklık reddi ve tümör oluşumu 4,5 gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, bir hücre barındırmayan bir yaklaşım rejeneratif tıpta ve yaşlanma müdahaleler 6,7 için alternatif bir tedavi stratejisini sağlayabilir.

Yaşlılık büyüme durması, değişmiş hücre fizyolojisi ve davranışları sürekli devlet tarafından karakterize doku ve organların yaşlanması, bir hücresel meslektaşı olarak görülüyor. kanser dahil yaygın hastalıklar, kardiyovasküler hastalık, t ana risk faktörüdür Yaşlanma2 diyabet ype ve nörodejenerasyon 8. Yaşlanmanın bariz özelliklerinden biri kök hücre yaşlanması ve bitkinlik 9 kaynaklanan dokuların rejeneratif potansiyelinin, düşüş olduğunu. Birçok önemli çalışmalar, sürekli yaşlanmayı geciktirmek ve ömrünü uzatmak için yeteneği var rapamisin 9, resveratrol 10, ve metformin 11 ve kan yoluyla bulaşan sistemik faktörler, yani GDF11 12 gibi farmakolojik molekülleri göstermiştir.

Bu çalışmada, Mesc-CM, serum faktörleri ve MEF'lerden salgısal faktör kontaminasyonu ortadan kaldırır serumsuz (fetal inek serumu, FBS) ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) katmanları hasat edilmiştir. dolayısıyla Mesc özgü salgı faktörlerin doğru tespit etkin bir serum- ve besleyici içermeyen CM izin Bu koşullar.

Bu önerilen protokol nispeten yüksek verimli, etkin maliyet ve kolayçalıştırmak için. Bu teknik, yaşlanma ile ilişkili hastalıklar ve diğer yenileme için girişimler karşı güvenli ve potansiyel olarak avantajlı bir hücresiz terapötik bir yaklaşım geliştirilmesi için kullanılabilecek bir anti-yaşlılık etkisi aracılık edebilen Mesc türetilen çözünür faktörlerin tanımlanması, kavranmasını sağlar tedaviler.

Protocol

Not: serum- ve besleyici-CM toplama protokolün bir şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir. 1. Malzemeler (MEFS Hazırlanması, Orta, Tabaklar, ve Çözümler) Kültür MEF'ler orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS (ESC kalitesi), 50 birim / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) Supplement. Kurulmuş bir rutin protokolü 13 aşağıdaki embriyolar MEFS ayırmak ve MEF ortamda onları korumak. kült?…

Representative Results

Başlangıçta, mESCs FBS ve diğer ek (Şekil 1 A ve 2A) ile Mesc ortam içinde bir MEF besleyici tutulur. CM besleyici tabaka FBS ya da diğer ek (Şekil 1B ve 2B) olmadan düşük serum ortamında mESCs toplanmıştır. Bu kültür durum bize besleyici, FBS veya diğer takviyeleri faktörler tarafından potansiyel kirlenme olmadan klimalı ortam Mesc-özgü toplamak için izin verir. Kontrol ortamı mESCs olmadan ayn?…

Discussion

serum- ve besleyici içermeyen Mesc-CM başarıyla toplanması için aşağıdaki öneriler dikkate alınmalıdır. En önemli faktör Mesc-CM toplanması için erken geçiş mESCs kullanıyor. Daha önce, bu erken geçiş Mesc-CM geç geçişli mESCs göre daha iyi bir anti-yaşlanma etkileri olduğu gösterilmiştir. MESCs geçiş sayısı gelişim potansiyeli 16 ve pluripotensini 17 etkilediği bildirilmiştir.

Ek araştırmalar, anti-yaşlılık etkilere neden Mesc …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A2060930) ve Tıbbi Araştırma Merkezi Programı (2015R1A5A2009124) Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (UÇK), Bilim, BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen ve Gelecek Planlama tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda Hastanesi Çocuk Hastalıkları (HK Sung) bir Başlangıç ​​İşletim Grant tarafından desteklenmektedir. Biz G4 Mesc hattını sağlamak için bu el yazması ve Dr. Andras Nagy düzenleme onların mükemmel yardım için Laura Barwell ve Sarah JS Kim teşekkür etmek istiyorum.

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Play Video

Cite This Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

View Video