Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores
Summary
O protocolo de cultura leptomeninges explante a partir de cérebro pós-morte humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar fibroblastos meninges fibronectina-positiva dentro de 6-8 semanas e criopreservação de aproximadamente 20-30 milhões de células.
Abstract
Apesar de grandes progressos foram feitos na caracterização clínico da doença de Parkinson, vários estudos relatam que o diagnóstico da doença de Parkinson não é patologicamente confirmada em até 25% da doença clinicamente diagnosticada de Parkinson. Portanto, o tecido coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de doença de Parkinson idiopática pode ter uma alta taxa de erros de diagnóstico; portanto, os estudos in vitro a partir de tais tecidos para estudar a doença de Parkinson como um modelo pré-clínico pode tornar-se inútil.
Através da recolha leptomeninges humanos pós-mortem com um diagnóstico neuropatológico confirmado de doença de Parkinson e caracteriza-se por perda de células nigroestriatal e inclusões de proteínas intracelulares denominadas corpos de Lewy, pode-se ter a certeza de que o parkinsonismo clinicamente observada não é causado por um outro processo de doença subjacente (por exemplo, de tumores, arteriosclerose).
Este protocolo presents a dissecação e preparação de leptomeninges humanos pós-morte para derivação de uma cultura de fibroblastos meníngea. Este processo é robusto e tem uma elevada taxa de sucesso. O desafio da cultura é esterilidade como a aquisição cérebro geralmente não é realizado sob condições estéreis. Portanto, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B.
A derivação de fibroblastos meninges de casos de autópsia-confirmadas com a doença de Parkinson fornece a base para a modelagem in vitro da doença de Parkinson. fibroblastos meninges aparecem 3-9 dias após a preparação da amostra e cerca de 20-30 milhões de células podem ser criopreservados em 6-8 semanas. A cultura de fibroblastos meníngea é homogéneo e as células expressam fibronectina, um marcador comumente usado para identificar as meninges.
Introduction
Meninges constituído por três membranas que protegem o cérebro: dura-máter máter, aracnóide e pia. Mais recentemente, tem sido reconhecido que as meninges também desempenham um papel importante no desenvolvimento do cérebro e do cérebro 1 homeostase. Meninges são derivadas de mesênquima e células derivadas da crista neural e interessantemente, foi mostrado que as células progenitoras que residem em meninges pode dar origem a neurónios in vitro e in vivo após o transplante 2, 3, 4. Culturas meninges foram também utilizados com sucesso como camadas alimentadoras, como eles possuem actividade indutora derivada de células de estroma para a diferenciação de células estaminais embrionárias em neurónios dopaminérgicos 5. Além disso, leptomeninges têm o potencial para se diferenciar em neurónios directamente, astrócitos, oligodendrócitos e sob condições isquémicas 6.
Para este protocolo, as amostras de meninges pós-morte humanos são recolhidos a partir do aracnóide e pia, chamados coletivamente os leptomeninges, e são adquiridos como parte de uma doação cérebro humano para fins de pesquisa. Dissecção do cérebro é realizada dentro de 24 h da morte e da amostra leptomeninges é colocado em meio de cultura frio para posterior processamento dentro do próximo 6-8 h, conforme ilustrado aqui neste protocolo.
Este protocolo descreve a dissecção e a preparação de amostras de meninges humanos para o desenvolvimento de culturas de células primárias leptomeninges paciente. O tecido é cortado em pedaços de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm quadrados. Três peças são colocadas em cada poço de 6 poços e realizou-se com lamelas de vidro redondas revestidas com gelatina. A dissecção meninges leva cerca de 25-35 minutos. O principal desafio com esta cultura é a esterilidade como a aquisição cérebro, transporte e dissecção geralmente não são realizados em condições estéreis. Tor conseguinte, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B e usar pratos de poços múltiplos para separadamente pedaços de tecido de cultura.
Crescimento de fibroblastos meníngeos ocorre geralmente dentro da primeira semana. Meios é mudada a cada dois ou três dias até que as células estão confluentes, e as células são passadas enzimaticamente. Os fibroblastos meninges são criopreservadas em 1 milhão de células por mL / recipiente em mídia criopreservação. Com este protocolo, 20-30 milhões de fibroblastos meninges pode ser derivado de 6-8 semanas para a criopreservação. aplicações a jusante desses fibroblastos meninges são culturas primárias para a pesquisa da doença, a diferenciação neuronal direta ou derivação de células-tronco pluripotentes induzidas a partir das leptomeninges para a compreensão dos mecanismos da doença e para o desenvolvimento de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um protocolo simples e robusto para derivar de uma cultura de fibroblastos a partir de meninges leptomeninges postmortem humanos recolhidos em conjunto com uma doação cérebro. Há muito poucas descrições de protocolos para derivar culturas de células a partir de material humano post-mortem. Dois estudos descrevem culturas de fibroblastos 7, 8, derivados de pele 9, um estudo descreve amostras da dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
