Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet
Summary
Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.
Abstract
Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) müssen vollständig in spezifische Zelltypen vor der Verabreichung unterschieden werden, aber herkömmliche Protokolle für hiPSCs in Kardiomyozyten (hiPSC-CMs), Endothelzellen (hiPSC-ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs) Differenzieren sind oft begrenzt durch geringe Ausbeute, Reinheit und / oder schlechter phänotypische Stabilität. Hier stellen wir neue Protokolle zum Erzeugen hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs, die wesentlich effizienter als herkömmliche Verfahren sind, sowie ein Verfahren zum Kombinieren von Zellinjektion mit einem Cytokin Haltiges Pflaster über der Verabreichungsstelle geschaffen. aus dem Myokard gequetscht, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen längeren Zeitraum der Patch verbessert sowohl die Beibehaltung der injizierten Zellen, indem die Nadelbahn Abdichten der Zellen aus zu verhindern. In einem Schweinemodell der myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung, war die Rate der Verpflanzung mehr als das Zweifache größer, wenn dieZellen wurden mit dem Zytokin Haltiges Pflaster zu den Zellen ohne Patch vergleicht verabreicht und die Behandlung sowohl mit den Zellen und dem Patch, aber nicht mit den Allein-Zellen wurde mit signifikanten Verbesserungen in der Herzfunktion und die Infarktgröße zugeordnet ist.
Introduction
Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gehören zu den vielversprechendsten Mittel für die regenerative Zelltherapie, weil sie in eine potenziell unbegrenzte Reichweite und Menge der Zellen unterschieden werden können, die durch den Patienten Immunsystem abgestoßen werden nicht. Aber ihre Fähigkeit zur Selbstreplikation und die Differenzierung kann auch zur Tumorbildung führen und folglich müssen hiPSCs vollständig in spezifische Zelltypen zu differenzieren, wie Kardiomyozyten (CMs), Endothelzellen (ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs ), vor der Verabreichung. Eine der einfachsten und häufigsten Methoden der Zell Verabreichung direkte intramyokardiale Injektion, aber die Anzahl der transplantierten Zellen, die von der nativen Herzmuskelgewebe transplantiert werden, ist außerordentlich gering. Ein Großteil dieser Abrieb kann auf die zytotoxische Umgebung des ischämischen Gewebes zugeschrieben werden; Wenn jedoch murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurden direkt in das Myokard von unversehrten Herzen injiziert, only ~ 40% der 5 Millionen Zellen wurden für 3-5 h 1, behielt geliefert , die ein wesentlicher Teil der verabreichten Zellen legt nahe , dass die Applikationsstelle verlassen, vielleicht , weil sie durch die hohen Drücke durch die Nadelbahn herausgedrückt erzeugt während Myokardkontraktion.
Hier stellen wir neuartige und wesentlich effizientere Methoden zur Erzeugung hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) 2, Endothelzellen (hiPSC-ECs) 3 und glatten Muskelzellen (SMCs) 4. Bemerkenswert ist , ist dies hiPSC-SMC – Protokoll die ersten , die breite Palette von morphologischen und funktionellen Eigenschaften in somatischen SMCs 5 beobachtet zu imitieren , indem die Zellen in Richtung einer überwiegend synthetische oder Kontraktions SMC – Phänotyp zu lenken. Wir stellen auch ein Verfahren zur Zellabgabe, die durch die Schaffung eines Cytokin-enthaltenden Fibrin p die Transplantationsrate von injizierten Zellen verbessertAtch auf die Injektionsstelle. Der Patch erscheint beide Zellretention zu verbessern, indem der Nadelbahn Abdichten der Zellen aus dem Verlassen des Myokards, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen Zeitraum von mindestens drei Tage zu verhindern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verbesserte Ausbeute / Reinheit von hiPSC-CMs
Herkömmliche Protokolle für die oft menschliche Stammzellen in CMs Differenzierung durch eine geringe Ausbeute und Reinheit begrenzt; zum Beispiel erhalten nur 35-66% der hESC-CMs über Percoll Trennung und Herzkörperbildung langsam Myosin schwere Kette oder cTnT 6 ausgedrückt. Die Reinheit von differenzierten hiPSC-CM – Populationen im wesentlichen durch die Auswahl für die Expression eines Reportergens erhöht werden, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
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