Плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток сердца для инфарктом Ремонт
Summary
Мы представляем три новых и более эффективных протоколов дифференцировки человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры и способ доставки, который улучшает приживление пересаженных клеток путем объединения инъекции клеток с патч-опосредованной доставки цитокина.
Abstract
Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток перед введением, но обычные протоколы для дифференциации hiPSCs в кардиомиоциты (hiPSC-КМВ), эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС), и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) часто ограничена низким выходом, чистотой, и / или плохой стабильности фенотипической. Здесь мы представляем новые протоколы для генерации hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs, которые могут быть значительно более эффективными, чем традиционные методы, а также способ объединения инъекции клеток с цитокинами, содержащий патч, созданный по месту введения. Пластырь улучшает как удерживание инжектированных клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от вытесняют из миокарда и выживаемости клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение длительного периода. В свином модели повреждений миокарда после ишемии-реперфузии, скорость приживления была более чем в два раза больше, когдаКлетки вводили с цитокинами, содержащий пластырь по сравнению с клетками без пластыря, и лечение обоими клетками и пластыря, но не с одним только клетками, было связано со значительным улучшением функции сердца и размера инфаркта.
Introduction
Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) являются одними из наиболее перспективных агентов для регенеративной клеточной терапии, потому что они могут быть дифференцированы в потенциально неограниченного круга и количества клеток, которые не отторгаются иммунной системой пациента. Тем не менее, их способность к самовоспроизведению и дифференциации может также привести к образованию опухоли и, следовательно, hiPSCs должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток, такие как кардиомиоциты (КМВ), эндотелиальные клетки (ПАУ) и клеток гладкой мускулатуры (СМЦ ), перед введением. Одним из наиболее простых и наиболее распространенных способов введения клеток является прямым интрамиокардиальной инъекции, но количество трансплантированных клеток, которые привиты нативным ткани миокарда является исключительно низким. Большая часть этого истирания может быть связано с цитотоксической среды ишемизированной ткани; Однако, когда мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) вводили непосредственно в миокарде неповрежденных сердца, оолько ~ 40% из 5 миллионов клеток доставленных были сохранены в течение 3-5 ч 1, что свидетельствует о том , что значительная часть вводимых клеток покинул сайт администрации, возможно , потому , что они были вытеснены через игольное дорожки с помощью высоких давлений , создаваемых в ходе инфаркт сокращение.
Здесь мы представляем новые и значительно более эффективные методы для генерации hiPSC полученных из кардиомиоцитов (hiPSC-КМВ) 2, эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС) 3, и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) 4. Следует отметить, что этот протокол hiPSC-SMC является первым , чтобы имитировать широкий спектр морфологических и функциональных характеристик , наблюдаемых в соматической SMCs 5, направляя клетки к преимущественно синтетическим или сократительной фенотипа SMC. Мы также предлагаем способ доставки клеток, что повышает скорость приживления клеток, инъецированных путем создания цитокинами, содержащей фибрин-рATCH над местом инъекции. Пластырь по-видимому, улучшить и удержания клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от выхода из миокард, и выживаемость клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение по крайней мере трех дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Повышение доходности / Чистота hiPSC-CMs
Обычные протоколы для дифференциации человеческих стволовых клеток в CMs часто ограничены низким выходом и чистотой; например, только 35-66% ЭСК-CMs получают путем разделения перколла и формирования сердечной тела выражается медленную тяж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
