تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
يحدث تكرار الجينوم خلال المرحلة S من دورة الخلية في عملية عالية التنظيم الذي يضمن الإخلاص من الازدواجية الحمض النووي. يتم نسخ كل منطقة الجينومية في وقت مميز خلال المرحلة S من خلال تفعيل المتزامن من أصول متعددة من النسخ المتماثل. الوقت من التكرار (المرجعية) يرتبط مع العديد من الميزات الجينومية وجينية ويرتبط معدلات الطفرات والسرطان. فهم وجهة النظر الجيني الكامل لبرنامج النسخ المتماثل في الصحة والمرض هو هدف مستقبل كبير والتحدي.
توضح هذه المقالة بالتفصيل "نسخ الرقم نسبة S / G1 لرسم خرائط الجينوم الوقت من النسخ المتماثل" طريقة (وتسمى هنا: لجنة المصالحة الوطنية-TOR)، مقاربة بسيطة لرسم خريطة الجينوم واسعة الاختصاصات من خلايا الثدييات. وتستند هذه الطريقة على أرقام نسخ مختلفة بين الخلايا مرحلة S وخلايا المرحلة G1. يتم تنفيذ طريقة CNR-الاختصاصات في 6 خطوات: 1. إعداد الخلايا وتلطيخ مع يوديد propidium (PI)؛ 2. سورتينغ G1 والخلايا مرحلة S باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)؛ تنقية 3. الحمض النووي. 4. صوتنة. 5. إعداد مكتبة والتسلسل. و6. تحليل بيوينفورمتيك. طريقة CNR-اختصاصات هو نهج سريع و سهل أن يؤدي إلى خرائط مفصلة تكرارها.
Introduction
تكرار الحمض النووي الثدييات غير المنظم بإحكام لضمان تكرار الدقيق لكل كروموسوم بالضبط مرة واحدة خلال دورة الخلية. يحدث النسخ المتماثل وفقا لترتيب منظم للغاية – متعددة المناطق الجينومية كبيرة (~ ميجا بايت) تكرار في بداية مرحلة S (تكرار في وقت مبكر المجالات) في حين أن مناطق الجينوم أخرى تكرار لاحقا في (المجالات منتصف وأواخر تكرار) منتصف أو المرحلة S أواخر 1. معظم الجينوم يعيد في نفس الوقت في جميع الأنسجة (المجالات المرجعية التأسيسية)، في حين أن 30٪ – 50٪ من الجينوم، والتغيرات اختصاصاتها بين الأنسجة 2، خلال التمايز 3 و 4 و إلى حد أقل أيضا خلال السرطان تحول 5 . وعلاوة على ذلك، بعض المناطق الجينومية تكرار بشكل غير متزامن 6، 7، 8، وهي أن هناك فرقافي الاختصاصات بين الاليلين.
اختصاصات يرتبط مع العديد من الميزات الجينومية وepigenomic بما في ذلك مستويات النسخ، والمحتوى GC، دولة لونين، كثافة الجينات، الخ 1 و 9. ويرتبط الاختصاصات أيضا مع معدلات الطفرة وأنواع 10، 11، وبالتالي لا يثير الدهشة، وترتبط اضطرابات من برنامج النسخ المتماثل إلى السرطان 12 و 13. العلاقة السببية بين اختصاصات وهيكل لونين ليست مفهومة حتى الآن. فمن الممكن أن ونين مفتوحة يسهل تكرارها في وقت مبكر. ومع ذلك، يشير نموذج بديل لونين يتم تجميعها أثناء النسخ المتماثل والمنظمين لونين مختلفة موجودة في بداية ونهاية المرحلة S الرصاص لتباين تغليف المبكرة والمتأخرة المناطق تكرار 1، 14 </sup>. لقد أظهرنا مؤخرا أن اختصاصات الأشكال محتوى GC من خلال التأثير على نوع من الطفرات التي تحدث في مناطق الجينوم مختلفة 11.
مضان في الموقع التهجين (FISH) هو الأسلوب الرئيسي لقياس الاختصاصات في مواضع الفردية. يتم تنفيذ ذلك ببساطة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا المرحلة S الذي يحمل إشارات سمكة واحدة مقابل نسبة من الحلل لإعطاء أليل 15 و 16. طريقة بديلة، ويتألف من نبض وصفها الحمض النووي مع BrdU، فرز الخلايا وفقا لمحتوى الحمض النووي لنقطة زمنية متعددة على طول S، immunoprecipitating الحمض النووي الذي يحتوي BrdU، والتحقق من وفرة من الحمض النووي عجلت مع QPCR 17.
رسم الخرائط المرجعية الجيني يمكن أن يتحقق من خلال طريقتين. الطريقة الأولى هي نسخة الجيني الأسلوب القائم BrdU-IP المذكورة أعلاه، والتي الكمي لكميةمن يتم الحمض النووي عجلت في كل جزء في وقت واحد لكامل الجينوم من خلال التهجين لميكروأرس أو التسلسل عميق. الطريقة الثانية، لجنة المصالحة الوطنية-الاختصاصات، يقوم على قياس عدد نسخة من كل منطقة الجينوم من الخلايا مرحلة S وتطبيع من محتوى الحمض النووي في الخلايا G1. في هذه الطريقة، يتم فرز الخلايا عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية في حالة عدم تكرار (المرحلة G1) وتكرار (المرحلة S) مجموعات (الشكل 1). الخلايا في G1 لها نفس عدد النسخ في جميع المناطق الجينومية، وبالتالي ينبغي أن يكون محتوى الحمض النووي نفسه. من ناحية أخرى، فإن عدد نسخ الحمض النووي في S يعتمد على المرجعية، منذ خضعت المناطق تكرار مبكرة تكرارها في معظم الخلايا وبالتالي تضاعف محتوى الحمض النووي، في حين لم تكرارها المناطق تكرار في وقت متأخر بعد في معظم الخلايا، وبالتالي سوف محتوى الحمض النووي تكون مماثلة لتلك الخلايا G1. وبالتالي S إلى نسبة G1 من محتوى الحمض النووي يدل على الاختصاصات. يتم قياس كمية الحمض النووي لكل منطقة الجينومية إما عن طريق التهجين لميكروأرس أو التسلسل عميق 2 و 8. وستتم مناقشة مزايا وطريقة CNR-الاختصاصات.
وتصف هذه الورقة طريقة جنة المصالحة الوطنية، اختصاصات لرسم الخرائط المرجعية الجيني كما هو موضح في الشكل (2). وتناقش الورقة التفاصيل الدقيقة للعملية برمتها من جمع الخلايا حتى التحليل الأساسي للنتائج وإنشاء الخرائط المرجعية الجينوم. وقد تم تنفيذ بروتوكول صفها في هذه الورقة بنجاح على مختلف أنواع الخلايا المزروعة في الثقافة. تحسينات في المستقبل من هذا البروتوكول يمكن أن يؤدي إلى تعيين من الاختصاصات في الجسم الحي وفي أنواع الخلايا نادرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لجنة المصالحة الوطنية-اختصاصات لا يمكن أن يؤديها من حيث المبدأ على أية مجموعة من السكان الخلايا المتكاثرة حقيقية النواة التي يمكن تقسيمها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية لS ومراحل G1 (التي استعرضتها Rhind N. وجيلبرت 20 DM). تم تعديل الطريقة الموصوفة هنا لخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأوريا فاردي للمساعدة في توليد أرقام. وأيد العمل في المجموعة هو من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 567/10) والمجلس الأوروبي للبحوث ابتداء غرانت (# 281306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
- Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
- Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).
- McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
- Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
- Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
- Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
- Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
- Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
- Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
- Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
