DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
게놈의 복제는 DNA 복제의 정확도를 보장하는 고도 조절 과정에서 세포주기의 S 단계에서 발생한다. 각각의 게놈 영역은 복제의 여러 기원의 동시 활성화를 통해 S 단계에서 고유 한 번에 복제됩니다. 복제 (ToR의)의 시간은 많은 게놈 및 후생 유전 학적 기능과 관련이 돌연변이 속도 암에 연결되어 있습니다. 건강과 질병에 복제 프로그램의 전체 게놈보기를 이해하는 것은 중요한 미래의 목표와 도전이다.
, 포유 동물 세포의 게놈 넓은 Tor를지도 할 수있는 간단한 방법이 문서에서는 구체적으로 (CNR-ToR의 여기라고 함) 방법을 "복제의 게놈 시간을 매핑하기위한 S / G1 복사 수 비율"을 설명합니다. 이 방법은 S 단계 및 G1 세포 상 세포 사이의 카피 수의 차이에 기초한다. CNR-토르 방법은 6 단계로 수행됩니다 요오드화 프로피 듐 (PI)와 세포 염색 1. 준비; 2. 소르팅 G1 및 정렬 형광 – 활성화 된 세포를 사용하여 S 상 세포 (FACS); 3. DNA 정화; 4. 초음파 처리; 5. 도서관 준비 및 순서; 및 (6) 바이오 인포 매틱스 분석. CNR-토르 방법은 상세한 복제지도 결과를 빠르고 쉽게 접근이다.
Introduction
포유 동물 DNA 복제는 세포주기 동안 회만 각 염색체의 정확한 복제를 보장하기 위해 엄격하게 조절된다. 복제는 매우 통제 된 순서에 따라 발생 – 여러 큰 게놈 영역 (~ 메가가) 다른 게놈 영역이 중간 또는 늦게 S 단계 (중 · 후반 복제 도메인)에서 나중에 복제 반면 1 (초기 도메인 복제) S 단계의 시작 부분에 복제합니다. 게놈의 50 %, 암 변환 5 중 분화 3,4- 중 및 적은 정도로 조직 (2) 사이의 토르 변화 – 게놈의 대부분은 30 % 반면, 모든 조직 (항시 토르 도메인)에서 동시에 복제 . 또한, 특정 게놈 영역 비동기 6, 7, 8, 즉 차이가 복제두 대립 유전자 사이의 토르있다.
토르 전사 수준, GC 함량, 염색질 상태, 유전자 밀도 등 1, 9를 포함하여 많은 게놈 및 에피 지노믹스 기능 상관 관계. 또한 ToR의 돌연변이 레이트 및 유형 10, 11, 따라서 당연히과 관련된 복제 프로그램의 교란은 암 (12, 13)에 연결되어있다. ToR의와 크로 마틴 구조 사이의 인과 관계는 아직 이해되지 않습니다. 열린 염색질 초기 복제를 용이하게하는 것이 가능하다. 그러나, 다른 모델은 14 염색질 복제하는 동안 조립 및 다른 염색질의 시작 부분에 존재하는 규제 및 S 상 리드의 끝이 초기와 후기 복제 영역 1의 포장을 차동 제안 </sup>. 우리는 최근 Tor가 다른 게놈 영역 (11)에서 발생하는 돌연변이의 종류에 영향을 미치는하여 GC 함량을 모양 것으로 나타났습니다.
현장 하이브리드 (FISH)의 형광 개별 궤적에서 Tor를 측정하기위한 주요 방법이다. 이것은 단일 FISH 신호 대 특정 대립 유전자 (15, 16)에 대한 이중선의 비율을 나타내는 S 단계에서 세포의 비율을 계산하여 간단히 수행된다. 또 다른 방법은, S 함께 여러 시점에 자신의 DNA의 내용에 따라 세포를 분류, BrdU의와 DNA 라벨 BrdU의를 포함하는 DNA를 immunoprecipitating 및 qPCR에 17 침전 된 DNA의 풍요 로움을 확인 펄스로 구성되어 있습니다.
게놈 토르 매핑은 두 가지 방법에 의해 달성 될 수있다. 첫 번째 방법은 상술의 BrdU-IP 기반 방법의 게놈 버전 인 양의 정량화각 부분에 침전 된 DNA를 마이크로 어레이에 하이브리드를 통해 전체 게놈 또는 깊은 시퀀싱에 의해 동시에 수행된다. 두 번째 방법, CNR-토르, G1 세포의 DNA 함량으로 S 상 세포 정규화 각 게놈 영역의 카피 수를 측정에 기초한다. 이 방법에서는, 세포는 비 복제 (G1 단계) 및 복제 (S 상) 그룹 (그림 1)에 FACS으로 분류되어 있습니다. G1 세포 게놈 영역 모두에서 동일한 카피 수 있고, 따라서 자신의 DNA 함량은 동일해야한다. 한편, S의 DNA의 카피 수는 후기 복제 영역 따라서 그들의 DNA 함량이 경우 대부분 세포를 복제하지 않은 반면, 초기 복제 영역은 대부분의 세포 내에서 복제를 시행하고, 이렇게해서 DNA 함량이 배가되므로, 토르에 따라 G1 세포의 것과 유사하다. 따라서 DNA 함량 G1 비율로 S는 토르 나타낸다. 각 게놈 영역에 대한 DNA의 양에 의해 혼성화를 측정마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱 (2), (8)에 의해. CNR-토르 방법의 장점은 더 논의 될 것이다.
그림 2에 기술 된 바와 같이 본 논문은 게놈 ToR의 매핑에 사용되는 CNR-토르 방법을 설명합니다. 이 논문은 결과의 기본 분석 및 게놈 ToR의지도를 만들 때까지 세포를 수집에서 전체 공정의 미세한 세부 사항에 대해 설명합니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 성공적 문화에서 자란 다양한 세포 유형에 수행되었습니다. 이 프로토콜의 향후 개선은 생체 내에서 토르의 매핑 희귀 세포 유형으로 이어질 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-토르 (린드 N. 길버트 DM (20)에 의해 평가) S로 FACS 및 G1 단계로 분할 될 수있는 진핵 세포 증식 세포 집단에 원칙적으로 수행 될 수있다. 여기에 기재된 방법은 인간 및 마우스 등 ~ 3 GB가 게놈 크기의 포유 동물 세포로 조정되었다. (전지 제조 및 시퀀싱 깊이)를 CNR-토르 프로토콜의 작은 변화는 다른 진핵 생물로 조정하기 위해 필요하다. 는 속도 제한 단계이기 때문에주의가 S ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 수치를 생성에 도움을 오리야어 Vardi 감사합니다. 는 IS 그룹의 작품은 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 10분의 567)와 그랜트 (# 281306)를 시작 유럽 연구위원회에 의해 지원되었다.
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
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