Gerichte plasmamembraan Levering van een hydrofobe Cargo ingekapseld in een Liquid Crystal nanodeeltjes Carrier
Summary
Vloeibaar kristal nanodeeltje (LCNP) Nanodrager wordt benut als middel voor de gecontroleerde afgifte van een hydrofoob lading naar de plasmamembraan van levende cellen.
Abstract
De gecontroleerde afgifte van geneesmiddel / beeldvormingsmiddelen cellen is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en voor de studie van cellulaire signaleringsprocessen. Onlangs, nanodeeltjes (NP) zijn veelbelovend in de ontwikkeling van dergelijke afgiftesystemen getoond. Hier is een vloeibaar kristal NP (LCNP) gebaseerde afgiftesysteem toegepast voor de gecontroleerde afgifte van een in water oplosbare kleurstof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO), vanuit de NP kern het hydrofobe gebied van een plasma membraan dubbellaag. Tijdens de synthese van de NP werd de kleurstof efficiënt opgenomen in de hydrofobe kern LCNP, zoals bevestigd door meerdere spectroscopische analyses. Conjugatie van een gePEGyleerd cholesterolderivaat de NP oppervlak (DIO-LCNP-PEG-Chol) kon de binding van de kleurstof beladen NPs naar de plasmamembraan in HEK 293T / 17 cellen. Tijdsgeresolveerde laser scanning confocale microscopie en Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming bevestigde de pasive uitstroom van DIO uit de LCNP kern en het inbrengen in het plasmamembraan dubbellaag. Ten slotte is de levering van DIO als LCNP-PEG-Chol verzwakt de cytotoxiciteit van DIO; de NP vorm van Dio tentoongesteld ~ 30-40% minder toxiciteit in vergelijking met Dio gratis geleverd vanuit bulk-oplossing. Deze benadering demonstreert de bruikbaarheid van de LCNP platform als efficiënte modaliteit voor membraan-specifieke afgifte en modulatie van hydrofobe moleculaire ladingen.
Introduction
Sinds de komst van interfacing nanomaterialen (materialen ≤100 nm in ten minste één dimensie) met levende cellen, is een voortdurend doel geweest om te profiteren van de unieke grootte-afhankelijke eigenschappen van nanodeeltjes (NP) voor verschillende toepassingen. Deze toepassingen omvatten weefsel- en labeling / beeldvorming (zowel in vitro als in vivo), real-time detectie en de gereguleerde afgifte van geneesmiddelen en andere ladingen 1. Voorbeelden van dergelijke relevante NP eigenschappen zijn onder andere de grootte-afhankelijke uitstoot van halfgeleider nanokristallen (quantum dots, QDs); de fotothermische eigenschappen van gouden nanodeeltjes; de grote laadcapaciteit van de waterige kern van liposomen; en de ballistische geleidbaarheid van koolstof allotropen, zoals enkelwandige koolstofnanobuizen en grafeen.
Meer recent heeft aanzienlijke interesse ontstaan in het gebruik van NPs voor de geregelde modulatie van drugs en andere ladingen, zoals contrast / a beeldvormingheren. Hier, de reden is om aanzienlijk te verbeteren / optimaliseren van de totale oplosbaarheid, toegediende dosis, de circulatie tijd, en de uiteindelijke goedkeuring van de drug lading door het leveren van het als een NP formulering. Dit is bekend geworden als NP-gemedieerde geneesmiddelafgifte (NMDD) aan, en er zijn nog zeven FDA goedgekeurde NP geneesmiddelformuleringen voor gebruik in de kliniek verschillende kankers en honderden meer in verschillende stadia van klinische proeven behandelen. In wezen is het doel om "meer met minder te bereiken;" dat wil zeggen, de NP als een scaffold meer-medicijn met minder dosering besturen door gebruik te maken van het grote oppervlak: volume (bijvoorbeeld, harde deeltjes, zoals QDs en metaaloxiden) NPS of hun grote binnenruimte voor laden grote vracht ladingen (bijvoorbeeld liposomen of micellen). Het doel hiervan is om de noodzaak voor meerdere systemisch afgeleverd doseringsregimes verminderen terwijl het tegelijkertijd bevorderlijk waterige stabiliteit en verbeterde circulatie, met name vooruitdagende hydrofoob geneesmiddel dat ladingen, terwijl zeer effectief, matig oplosbaar in waterige media.
Aldus is het doel van de hierin beschreven werk was om de levensvatbaarheid van het gebruik van een nieuwe NP matrix voor de specifieke en gecontroleerde afgifte van hydrofobe ladingen aan de lipofiele plasmamembraan bilaag bepalen. De motivatie voor het werk was de inherente beperkte oplosbaarheid en moeilijkheden bij de levering van hydrofobe moleculen aan cellen uit waterige media. Typisch, de levering van dergelijke hydrofobe moleculen vereist het gebruik van organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld DMSO) of amfifiele oppervlakteactieve stoffen (bijvoorbeeld Poloxameren), die toxisch en compromissen cel- en levensvatbaarheid van het weefsel 2 of micel dragers kunnen, waarin de interne belasting kan beperkt capaciteiten. De NP carrier hier gekozen was een nieuw vloeibaar kristal NP (LCNP) formulering eerder ontwikkelde 3 en dat was eerder aangetoond dat een ~ 40-voudig bereiken verbetering van de werkzaamheid van het antikankermiddel doxorubicine in gekweekte cellen 4.
In de hierin beschreven werk, de vertegenwoordiger van de lading gekozen was de potentiometrische membraan kleurstof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO). DIO is een in water onoplosbare kleurstof die is gebruikt voor anterograde en retrograde traceren in levende en vaste neuronen, membraanpotentiaal metingen, en voor algemene membraan labeling 5, 6, 7, 8, 9. Door de hydrofobe aard is DIO gewoonlijk rechtstreeks toegevoegd aan celmonolagen of weefsels in een kristallijne vorm 10, of het wordt geïncubeerd bij zeer hoge concentraties (~ 1-20 uM) na verdunning van een concentratie stockoplossing 11, 12.
content "> Hier de benadering gebruik de LCNP platform, een multifunctioneel NP waarvan de binnenkern volledig hydrofoob en waarvan het oppervlak tegelijkertijd hydrofiel en vatbaar voor bioconjugatie, als transportmiddel Dio. Dio is opgenomen in de LCNP kern tijdens de synthese en de NP oppervlak wordt vervolgens gefunctionaliseerd met een gePEGyleerd cholesterol groep aan het membraan binding van het DIO-LCNP pakket bij het plasmamembraan bevorderen. Deze benadering resulteerde in een afgiftesysteem dat DIO verdeeld in het plasmamembraan met een grotere betrouwbaarheid en membraan residence tijd dan de vrije vorm van Dio geleverd vanuit bulk-oplossing (Dio gratis). Verder is deze methode is gebleken dat het-LCNP gemedieerde levering van DIO aanzienlijk moduleert en drijft het tempo van de specifieke verdeling van de kleurstof in de lipofiele plasmamembraan dubbellaag. dit is bereikt terwijl gelijktijdig de cytotoxiciteit van de vrije geneesmiddel door het leveren van het als een LCNP formulering verminderen door ~ 40%. <p class = "jove_content"> Verwacht wordt dat de hierin beschreven methode een krachtige techniek waarmee onderzoekers wier werk en vereist de cellulaire afgifte van sterk hydrofobe ladingen die slecht oplosbare of volledig onoplosbaar in waterige oplossing zal zijn.Protocol
Representative Results
Discussion
Een voortdurende doel van NMDD is de gecontroleerde targeting en afgifte van geneesmiddel formuleringen aan cellen en weefsels, in combinatie met gelijktijdige verbeterde werkzaamheid van het geneesmiddel. Een specifieke klasse van geneesmiddel moleculen, en is een belangrijke uitdaging gesteld hydrofoob drugs / beeldvormingsmiddelen die slecht tot geen oplosbaarheid in waterige media. Dit probleem heeft de overgang van krachtige geneesmiddelen geplaagd uit in vitro celkweek systemen om de klinische setting en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NRL Base Funding Program (Work Unit MA041-06-41-4943). ON wordt ondersteund door een National Research Council postdoctoraal onderzoek associateship.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . 生物化学. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
