Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat
Summary
Bir sıvı kristal nanopartikül (LCNP) nanocarrier canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik yük sürekli verilme için uygun bir araç olarak kullanılarak.
Abstract
hücrelere ilaç / görüntüleme maddeleri kontrollü dağıtım terapötik maddelerin geliştirilmesi için ve hücresel sinyal işlev çalışmaları için önemlidir. Son zamanlarda, nanopartiküller (NPS), teslimat sistemlerinin gelişiminde önemli söz göstermiştir. Burada, sıvı kristal NP (LCNP) tabanlı dağıtım sistemi, bir plazma hidrofobik bölgeye NP çekirdek içinde bir suda-çözünmeyen boya, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) kontrollü olarak bırakılmaları için kullanılmaktadırlar edilmiştir membran iki tabakalı. NPlerin sentezi sırasında, boya verimli çoklu spektroskopik analizleri ile teyit edildiği gibi, hidrofobik LCNP orta tabakasına dahil edilmiştir. NP yüzeyi (DIO-LCNP-PEG-Chol) bir PEG'lenmiş kolesterol türevi çekimi HEK 293T / 17 hücrelerinde plazma zarı boya yüklü NPS bağlanmasını sağladı. Zamana bağımlı lazer tarama konfokal mikroskopi ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme geçmek doğruladıLCNP çekirdek ve plazma zarı bilayeri içine yerleştirilmesi gelen Dio çıkışını ive. Son olarak, bir LCNP-PEG-Chol olarak Dio teslim Dio sitotoksisitesini zayıflatılmış; Dio NP formu Dio ücretsiz toplu bir çözüm teslim kıyasla ~% 30-40 daha az toksisite sergiledi. Bu yaklaşım, bir hidrofobik molekül yüklerin membran spesifik gönderimi ve düzenlenmesi için etkili bir yöntem olarak LCNP platformun faydasını ortaya koyar.
Introduction
canlı hücreler ile (en azından bir boyutta malzeme ≤100 nm) nanomalzemeler arayüz gelişiyle bu yana, sürekli bir gol çeşitli uygulamalar için nanopartiküller (NPS) benzersiz boyut özelliklerine yararlanmak olmuştur. Bu uygulamalar, hücre ve doku markalama / görüntüleme (in vitro ve hem de in vivo), gerçek zamanlı algılama ve ilaç ve diğer yüklerin 1 kontrollü olarak verilmesini içerir. Böyle İlgili NP özelliklerin örnekleri yarı iletken Nanokristallerin boyutu bağımlı emisyon (kuantum noktaları, QD'lerin) arasında; altın nanopartiküllerin fototermal özellikleri; Lipozomlar sulu iç kısım büyük yükleme kapasitesi; Bu tür tek duvarlı karbon nanotüpler ve grafen olarak karbon allotropes, ve balistik iletkenlik.
Daha yakın zamanlarda, önemli derecede bir faiz gibi kontrast / görüntüleme a gibi ilaçlar ve diğer yükler, kontrollü modülasyonu için NPS kullanımında ortaya çıkmıştırbeyler. Burada, gerekçe anlamlı / geliştirmek bir NP formülasyonu olarak sunarak ilaç kargo genel çözünürlüğü, teslim dozu, dolaşım süresi ve nihai açıklığı optimize etmektir. Bu NP-aracılı ilaç dağıtım (NMDD) olarak bilinen hale geldi ve çeşitli kanserler ve klinik çalışmaların çeşitli aşamalarında daha yüzlerce tedavisinde klinikte kullanılmak üzere yedi FDA onaylı NP ilaç formülasyonları şu anda. "Daha az ile daha başarmak;" Özünde, amaç etmektir diğer bir deyişle, geniş yüzey alanı yararlanarak daha az dozaj idareleri devamı getirilmiş ilacı uygulamak için bir iskele olarak NP kullanımı: hacim (örneğin, bu tür QDS ve metal oksitler gibi sert parçacıklar) NPS veya yükleme için geniş iç hacme büyük kargo yükleri (örneğin, lipozomlar veya miseller). Buradaki amaç, sulu istikrar ve gelişmiş dolaşımını teşvik ederken aynı zamanda, özellikle için, birden fazla sistemik teslim doz rejimleri için gerekliliğini azaltmakÇok etkili olmakla beraber, sulu ortamda çok az çözünen, zor hidrofobik ilaç yükler.
Bu nedenle, burada tarif edilen çalışmanın amacı lipofilik plazma zarı çift tabakaya hidrofobik yükün spesifik ve kontrollü verilmesi için, yeni bir NP iskele ile canlılığı belirlemekti. iş için motivasyon sulu ortamdan hücrelere hidrofobik moleküllerin teslim doğasında sınırlı çözünürlük ve zorluk oldu. Tipik haliyle, bu tür hidrofobik moleküllerin dağıtım iç yükleme sınırlı toksik ve uzlaşma doku ve hücre canlılığı 2 veya misel taşıyıcısı olabilir organik çözücüler (örneğin, DMSO) ya da amfifilik yüzey aktif (örneğin, Poloksamerler) kullanımını gerektirir kapasiteleri. Burada seçilen NP taşıyıcı önceden 3 geliştirilen yeni sıvı kristal NP (LCNP) formülasyonu ve bu ~ 40 kat ulaşmak için daha önce gösterilen olmuştu kültürlenmiş hücrelerde 4 antikanser ilaç doksorubisin etkinlikteki artış.
Burada tarif edilen çalışmada seçilmiştir Örnek kargo potansiyometrik membran boya, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) idi. DIO yaşam ve sabit nöronlar, membran potansiyeli ölçümlerde anterograd ve retrograd izleme için kullanılan bir suda çözülmeyen bir boya, ve genel membran etiketleme 5, 6, 7, 8, 9. Dolayı hidrofobik doğası, DIO, genellikle bir kristal formunda 10 hücre mono tabakaları veya dokulara doğrudan ilave edilir, ya da çok yüksek konsantrasyonlarda kuluçkaya yatırılır Bir konsantrasyon stok solüsyonu 11, 12 seyreltme sonra (~ 1-20 mcM).
içerik "LCNP platformuna> Burada, yaklaşımdır kullanımı, DIO. DIO için bir iletim aracı olarak olan iç kısım tam olarak hidrofobiktir ve, yüzeyi aynı zamanda, hidrofilik ve bioconjugation için uygun olan bir çok fonksiyonlu NP, sentez esnasında LCNP çekirdek içine dahil edilen ve NP yüzey daha sonra plazma zarına DIO-LCNP topluluğu zar bağlanmasını teşvik etmek için PEG'lenmiş kolesterol yarımı ile işlevlendirilmektedir. Bu yaklaşım daha fazla doğruluk ve membran ikamet plazma zarına DIO paylaştırıldı bir salma sistemi ile sonuçlanmıştır Dio serbest bir şekilde ana çözeltiye teslim kereden (DIO serbest). Ayrıca, bu yöntemle Dio LCNP aracılı teslim edilmesini düzenleyen ve lipofilik plazma zarı ikili katmanı içine boyanın özel bir bölme oranını teşvik ettiği görülmüştür. Bu, eş zamanlı bir LCNP formülasyonu olarak sunarak% 40 ~ tarafından serbest ilacın sitotoksisite düşürürken elde etti. <p cleşek = "jove_content"> tarifnamede tarif edilen yöntem işin içindeki ya da çok az çözülebilen veya sulu bir çözelti içinde tamamen çözülmez olan oldukça hidrofobik yüklerin hücresel gönderilmesini gerektirir araştırmacılar için güçlü bir izin tekniği olacağı tahmin edilmektedir.Protocol
Representative Results
Discussion
NMDD bir sürekli amacı aynı anda geliştirilmiş ilaç etkinliği ile kombine kontrol hedefleme ve hücre ve dokulara ilaç formülasyonlarının içerisinden dağıtım olmaktadır. Bu önemli bir sorun teşkil ettiği için ilaç moleküllerinin belirli bir sınıf sulu ortamda hiçbir çözünürlüğüne idareli sahip hidrofobik ilaçlar / görüntüleme ajanları olduğunu. Bu sorun, klinik ortamda in vitro hücre kültür sistemleri ile ilgili potansiyel ilaçların geçişi saran ve "raf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NRL Bankası Fonlama Programı (Çalışma Birimi MA041-06-41-4943) tarafından desteklenmiştir. ON Ulusal Araştırma Konseyi Doktora Sonrası Araştırma Associateship tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . 生物化学. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
