Summary

細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

Published: January 28, 2017
doi:

Summary

この記事では、識別し、細胞内染色によって、マウス腎臓、大動脈およびリンパ節内に存在する機能性Tリンパ球サブセットを定量化し、フローサイトメトリーするための詳細な方法論を提供します。アンジオテンシンII高血圧のモデルは、説明ステップバイステップ、手順、およびフローサイトメトリーの基本的原則及び細胞内染色に選ばれました。

Abstract

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Introduction

最近の証拠は、適応免疫系、特にTリンパ球は、いくつかの心血管疾患1,2,3,4,5の発症に重要な役割を果たしていることを示しています。例えば、アンギオテンシンII誘発性高血圧モデルでは、マウスの血管および腎臓におけるT細胞の蓄積を6に記載されています。血管の蓄積は、外膜と血管周囲脂肪に主にあります。腎臓では、T細胞は、髄質及び腎皮質の両方に蓄積します。関与するサブセットに応じて、これらのT細胞は、血管および腎臓の機能に影響を及ぼし、病理の発達をもたらすことができる別のサイトカインを生じる(マクマスター 6で概説)。

その機能と署名インサイトに基づいてTヘルパー1(Th1)、Th2を、TH9、Th17細胞、TH22、T調節(Treg細胞)細胞、およびT濾胞ヘルパー(TFH)細胞:CD4 + Tヘルパーリンパ球は、複数のサブセットに分割することができますkines 7。同様に、CD8 +細胞傷害性T細胞はTc1は、Tc2を、TC17またはTC9 8のように分類することができます。ダブルネガティブT細胞(CD4またはCD8 T細胞マーカーを発現しない、すなわち細胞)もあります。これらの細胞のサブセットは、代替ガンマデルタT細胞受容体(の代わりに古典的なαおよびβ受容体)を有し、したがって、ガンマデルタT細胞と呼ばれます。表面マーカー、サイトカインおよび転写因子のフローサイトメトリーによるマルチパラメータ分析は、これらの細胞を同定するための最適なアプローチを構成しています。この方法は、広く免疫学の分野で使用されるが、それはあまり固形臓器および心血管疾患の設定に記載されています。

歴史的には、組織中のリンパ球の同定は、免疫組織化学またはRT-PCRの手法に限定されていました。免疫組織化学および免疫蛍光は、int型の抗原の組織分布を決定するための強力な方法であるが、erest、彼らは表現型関連するサブセットを特定するには不十分です。 RT-PCR分析は、抗原、サイトカインまたは転写因子のmRNA発現を検出するのに有用であるがまた、それは、個々の細胞のレベルで、同時に複数のタンパク質の検出を可能にしません。

サイトカインおよび転写因子を検出するために、細胞内染色と組み合わせて、特にフローサイトメトリーの出現は、固形臓器における免疫細胞サブセットの単一細胞レベルでの同定および定量を可能にする強力な技術を持つ研究者を提供します。私たちは、アンジオテンシンII高血圧のモデルにおけるマウスの腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節内に存在する主要なT細胞サブセットをフローサイトメトリーによって識別するための細胞内染色アッセイを最適化しました。各ステップの最適化:組織消化、ex vivoでの活性化、透過処理、および表面および細胞内染色結果、高度で再他の心血管および腎疾患モデルに適用することができる製造可能検定。

Protocol

ヴァンダービルト大学の施設内動物管理使用委員会は、本明細書に記載される手順を承認しました。マウスは、飼育し、実験動物の管理と使用に関する指針に従って世話されている(国立アカデミープレス。改訂2010)。 マウスからの大動脈水切りリンパ節、腎臓および大動脈の1の単離 CO 2吸入によりマウスを安楽死させます。 70%エタノールで胸をスプレーし、慎重に?…

Representative Results

プロトコルは、許可をアンジオテンシンII誘発性高血圧モデルにおいて、マウス腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節から単離したT細胞における表面および細胞内マーカーの同定を記載しました。代表的な結果を以下に示します。 図1は、高血圧を誘導するために、アンジオテンシンIIを注入したWTマウ…

Discussion

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、フロリダ州に米国心臓協会フェローシップ賞(16POST29950007)、健康(NIH T32 HL069765)BLD、MAサレハにアメリカ心臓協会フェローシップ賞(14POST20420025)の国立研究所からの訓練助成金、およびNIHによってサポートされていましたMSMにK08賞(HL121671)。 MSMはまた、ギリアド・サイエンシズ社から研究助成金によってサポートされています

Materials

Collagenase D ROCHE 11088882001
Collagenase A ROCHE 10103586001
Collagenase B ROCHE 11088815001
Dnase ROCHE 10104159001
1X Red blood cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RPMI Medium 1614 1X Gibco 11835-030
DPBS without calcium and magnesium Gibco 14190-144
Percoll GE Healthcare 17-5445-02 For density gradient centrifugation
GentleMACS ™ C tube  Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A) Biolegend 423303
anti-CD16/32 eBioscience 14-0161-81 dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Life Technologies L34955
Transcription factor buffer set BD Pharmingen 562725
OneComp eBeads  eBioscience 01-1111-42
123 count eBeads eBioscience 01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11) BioLegend 103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) BioLegend 100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) BioLegend 506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8) BioLegend 517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) BD Biosciences 560181
CD8 APC (clone 53-67) eBioscience 17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) BioLegend 644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2) BD Biosciences 557724

References

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Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. J. Vis. Exp. (119), e55266, doi:10.3791/55266 (2017).

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