Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon
Summary
Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.
Abstract
Asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen bevatten de twee kopieën van een histon (zus histonen) versierd met verschillende sets van post-translationele modificaties (PTMs). Ze zijn recent ontdekte soorten met onbekende middelen van vestiging en functionele implicaties. De huidige analytische methoden zijn ontoereikend om de copy-specifieke optreden van PTMs op de nucleosomale zus histonen detecteren. Dit protocol geeft een biochemische werkwijze voor de in vitro reconstitutie van nucleosomen die verschillend isotoop gemerkte zuster histonen. De gegenereerde complex kan ook asymmetrisch gewijzigd, na waaronder een premodified histon zwembad tijdens het opnieuw vouwen van histon subes. Deze asymmetrische nucleosoom preparaten kunnen gemakkelijk worden omgezet met histon modificerende enzymen modificatie overspraak mechanismen die bij de asymmetrisch vooraf opgenomen PTM basis van kernspinresonantie (NMR) spectroscopie onderzoeken. In het bijzonder de modificatie reactiesreal-time kan onafhankelijk worden afgebeeld op de twee zuster histonen door het uitvoeren van verschillende NMR correlatie experimenten zijn afgestemd op de desbetreffende isotoop type. Deze methode biedt de mogelijkheid om overspraak mechanismen die bijdragen aan de vorming en verspreiding van asymmetrische PTM patronen op nucleosomale complexen bestuderen.
Introduction
Eukaryotische DNA is strak verpakt binnen celkernen in chromatine. De fundamentele bouwsteen van chromatine is de nucleosoom kerndeeltje dat ~ 147 bp van DNA gewikkeld rond een octamère complex bestaat uit twee exemplaren elk van de vier kern histonen (H3, H4, H2A, H2B) bevat. Histon-eiwitten haven een overvloed aan post-translationele modificaties (PTMs). Deze covalente substituties induceren veranderingen in de structuur van chromatine, zowel direct door het beïnvloeden van de fysische chemie van het systeem en indirect door het werven van chromatine remodeling activiteiten 1, 2, 3. Door deze middelen, histon fosforylatie controleren chromatine toegankelijkheid en daarmee regelen alle DNA-celfuncties 4.
PTMs worden geïnstalleerd door histon-modificerende enzymsystemen vooral op de ongestructureerde N-terminale segmenten (staarten) van nucleosomen opgenomen kern histones. Door de vele modificatieplaatsen op relatief korte sequentie van histone staarten, fosforylatie beïnvloeden elkaar door het induceren of blokkerende daaropvolgende modificatiereacties, een effect bekend als modificatie overspraak 5. Vanwege de symmetrische algehele architectuur van de nucleosoom, modificaties en overspraak mechanismen men dacht dat eveneens plaatsvinden op de twee kopieën van elk histon nucleosomale (zuster histonen). Dit concept werd onlangs uitgedaagd en vervolgens weerlegd. In het bijzonder, in vitro enzymatische assays op vrije histon H3 staart peptiden en nucleosomen aangetoond dat een reeks H3 kinases geïntroduceerd fosforylering in een asymmetrische wijze 6. Bovendien affiniteit-zuivering gebaseerde LC-MS / MS analyse bleek dat dit asymmetrisch H3 gemethyleerd nucleosomen in verschillende typen eukaryote cellen 7. Aldus asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen vormen nieuwe soorten, engereedschappen nodig om de mechanismen die de vorming ervan te regelen en het overspraak effect dat deze asymmetrie kan uitoefenen analyseren onthullen.
Gewoonlijk hebben Western blotting (WB) en massaspectrometrie analyse (MS) gebruikt om histon fosforylatie detecteren. Ondanks de eenvoudige toepassing, WB lijdt aan specificiteit / cross-reactiviteit problemen. Op de top van dat, het is niet in staat om het uitvoeren van simultane multi-PTM analyse en directe kwantificering van de wijziging reacties 8. Anderzijds, MS analyse maakt gebruik van verfijnde instrumentatie hoog niveau training vereist, maar biedt een hoge specificiteit en gelijktijdig in kaart brengen en kwantificeren van meerdere PTMs 9. Beide methoden zijn storend en nucleosomale complexen zijn gedissocieerd voor de analyse, waardoor een mengsel van histonen en / of histon afgeleide peptides. Deze manipulatie verwijdert de mogelijkheid om onderscheid te maken onafhankelijkemodificatiereacties die plaatsvinden op elk van de twee zuster histonen en de kopie modificatie status van de nucleosomale histonen melden.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopie ontwikkeld als alternatief voor PTM reacties kaart. NMR is niet-storende en aldus het toezicht PTM evenementen in een real-time wijze bereide mengsels, en ook in intacte cellen 10, 11. De ontwikkeling van routines voor snelle data acquisitie en voor hoge resolutie mapping op basis van 2D hetero-nucleaire correlatie methoden isotoop gemerkte (15 N en / of 13 C) monsters 12 toegelaten gelijktijdige toewijzing van verschillende PTMs dergelijke als serine / threonine / tyrosine fosforylering, acetylering lysine / methylatie en arginine methylatie 13. Afhankelijk van het doorvoermechanisme onderzochte 15 13 N- of C-labeling protocols kan worden toegepast om het eiwit functionele groep die als een modificatie reporter markeren. Bijgevolg kan PTM mapping worden uitgevoerd door de karakteristieke chemische verschuiving verplaatsing van de corresponderende functionele groep "sensing" de wijziging van de chemische omgeving. In de meeste gevallen, kunnen zowel NH en CH chemische groepen worden gebruikt om de ontwikkeling van het doorvoermechanisme plaats aangeven.
Het huidige protocol beschrijft de vorming van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Combineert de flexibiliteit van NMR-spectroscopie naar kaart PTMs met beide 1 H- 15 N en 1 H- 13 C correlatiespectra met het gebruik van verschillende eiwitten affiniteit tags voor zuivering van het geselecteerde gereconstitueerd histon complexen. Met name het protocol maakt gebruik van twee verschillende pools van een bepaald histon voor nucleosoom oplossen. Deze zwembaden zijn verschillend isotoop gemerkte (een met <sup> 15 N, de andere met 13 C), en worden gefuseerd met een polyhistidine- en een streptavidine tag affiniteit respectievelijk. Een tandem affiniteitszuivering regeling met Ni-NTA en streptavidine-gebaseerde chromatografie aanvankelijk gebruikt door Voigt et al. 7 wordt toegepast om asymmetrische species van symmetrische tegenhangers (Figuur 1A) zuiveren. Asymmetrische histon octameren worden vervolgens gebruikt om gelijkwaardige nucleosomale complexen (figuur 1B) te reconstrueren, met behulp van de standaard zout dialyse methode 14. Bovendien, volgens dezelfde procedure en door één van de histon pools pre-gemodificeerde, een doorvoermechanisme kan asymmetrisch worden opgenomen op de resulterende nucleosomen. De reactie van deze substraten met-histon-modificerende enzymen en daarop volgende NMR-in kaart brengen van de wijziging evenementen mogelijk te maken de karakterisering van crosstalk mechanismen zowel in cis (premodified histon kopiëren) en in-trans (unmodified histon copy) (figuur 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor nucleosoom reconstitutie, het huidige protocol maakt gebruik van een 165 bp lange DNA-template die de 601-Widom nucleosoom positionering reeks 20, maar vergelijkbare prestaties zal naar verwachting met behulp van verschillende lengtes van DNA templates. Het protocol werd ontworpen en gebruikt met behulp van asymmetrische vormen van histon H3. Hetzelfde principe kan de werkwijze ook worden toegepast voor andere kernhistonen en bovendien kan worden gebruikt om complexen die twee verschillende …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur bedankt Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlijn) voor het leveren van wet-lab ruimte en infrastructuur om experimenten en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) uit te voeren voor de financiering van het werk door middel van een onderzoeksbeurs (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
