Summary

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Published: March 26, 2017
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Summary

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

Abstract

nucleossomos assimetricamente modificados contêm as duas cópias de uma histona (histonas irmã) decorados com conjuntos distintos de modificações pós-traducionais (PTMS). Eles são recém-espécie identificada com meios desconhecidos de estabelecimento e implicações funcionais. métodos analíticos correntes são insuficientes para detectar a ocorrência específica contra cópia de PTMs sobre as histonas nucleossomais irmã. Este protocolo apresenta um método bioquímico para a reconstituição in vitro de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. O complexo gerado também pode ser assimetricamente modificada, após a inclusão de uma piscina histona premodified durante a redobragem de subcomplexos histonas. Estas preparações nucleossomos assimétricos podem estar prontamente reagiu com enzimas modificadoras de histonas para estudar modificação mecanismos de cross-talk impostas pela PTM assimetricamente pré-incorporados usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Em particular, as reacções de modificaçãoEm tempo real pode ser mapeado de forma independente nas duas histonas irmã através da realização de diferentes tipos de experiências de correlação de RMN, adaptados para o respectivo tipo de isótopos. Esta metodologia proporciona os meios para estudar os mecanismos de diafonia que contribuem para a formação e propagação de padrões PTM assimétricos em complexos nucleossomais.

Introduction

ADN eucariótico está firmemente embalados dentro de núcleos celulares em cromatina. O bloco de construção fundamental da cromatina é a partícula de núcleo que contém nucleossoma ~ 147 pb de ADN envolvida em torno de um complexo octam�ica constituído por duas cópias de cada um dos quatro histonas nucleares (H3, H4 e H2A, H2B). proteínas histona abrigar uma variedade de modificações pós-traducionais (PTMs). Estas substituições covalentes induzir alterações na estrutura da cromatina, tanto directamente ao afectar a química física do sistema e, indirectamente, através do recrutamento de actividades de remodelação da cromatina 1, 2, 3. Por esses meios, PTMs histonas controlar a acessibilidade da cromatina e, portanto, regular todas as funções celulares 4 baseados em DNA.

PTMs são instalados por sistemas de enzimas de modificação de histonas principalmente sobre os segmentos do terminal N não estruturados (caudas) de histo núcleo incorporou-nucleossomanes. Devido aos muitos locais de modificação no relativamente curta sequência de caudas das histonas, PTMs influenciam uns aos outros através da indução ou bloqueando reações posterior modificação, um efeito conhecido como modificação cross-talk 5. Devido à arquitectura geral simétrica do nucleossoma, reacções de modificação e os mecanismos de diafonia foram pensados ​​para ocorrer de forma semelhante para as duas cópias de cada histona nucleossomal (histonas irmã). Este conceito foi recentemente desafiado e posteriormente refutadas. Particularmente, in vitro ensaios enzimáticos sobre peptídeos cauda H3 histonas livre e em nucleossomos demonstraram que um conjunto de quinases H3 introduzido fosforilação de forma assimétrica 6. Adicionalmente, análise por LC-MS / MS com base em afinidade de purificação revelado a existência de nucleossomas assimetricamente metilada-H3 em vários tipos de células eucarióticas 7. Assim, nucleossomas assimetricamente modificados constituem novas espécies, eferramentas são necessárias para desvendar os mecanismos que controlam a sua formação e para analisar os efeitos crosstalk que esta assimetria pode exercer.

Comumente, Western Blotting (WB) e análise de espectrometria de massa (MS) foram utilizados para detectar PTMs histonas. Apesar de sua fácil aplicação, WB sofre de problemas de especificidade / reatividade cruzada. Em cima disso, é incapaz de realizar a análise multi-PTM simultânea e quantificação direta das reações de modificação 8. Por outro lado, a análise MS emprega instrumentação sofisticada que requer a formação de alto nível, mas proporciona uma elevada especificidade, assim como o mapeamento simultâneo e quantificação de múltiplos PTMs 9.   No entanto, ambos os métodos são perturbadores e os complexos são dissociados nucleossomais antes da análise, dando origem a uma mistura de histonas e / ou péptidos derivados de histona. Esta manipulação remove a capacidade de distinguir independentereacções de modificação que ocorrem em cada um dos dois histonas irmã e para relatar o status de modificação específicos de cópia das histonas nucleossomais.

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) nuclear evoluiu como um método alternativo para mapear reacções PTM. NMR é sem interrupções e, portanto, permite o monitoramento de eventos da PTM de uma forma em tempo real em misturas reconstituídos, e até mesmo em células intactas 10, 11. O desenvolvimento de rotinas para aquisição de dados rápida, bem como para o mapeamento de alta resolução com base em 2D métodos de correlação hetero-nuclear de amostras com isótopos marcado (15 N e / ou 13 C) 12 permitiram o mapeamento simultânea de diferentes tipos de PTMs, tais como serina / treonina / fosforilação da tirosina, lisina acetilação / metilação, arginina e metilação 13. Dependendo da PTM sob investigação, 15 N- ou 13 C-rotulagem protocols pode ser utilizado para marcar a proteína de grupo funcional que serve como um repórter modificação. Por conseguinte, o mapeamento PTM pode ser realizada seguindo o deslocamento do desvio químico característico do grupo funcional correspondente "sensing" a alteração no ambiente químico. Na maioria dos casos, ambos os grupos NH e CH químicas pode ser usada para informar a evolução da PTM de interesse.

O protocolo atual descreve a geração de nucleossomos contendo histonas irmã marcados com isótopos de forma diferenciada. Ela combina a flexibilidade da espectroscopia de RMN para mapear PTMs usando tanto um H- 15 N e 1 H- 13 C espectros de correlação com a utilização de diferentes marcadores de afinidade da proteína para a purificação dos complexos de histona reconstituídos seleccionados. Notadamente, o protocolo emprega duas piscinas diferentes de uma histona especial para reconstituição nucleossomo. Estas piscinas são diferencialmente marcado com isótopo (com um <suP> 15 N, o outro com 13 C), e eles são fundidos com um poli-histidina e uma etiqueta de afinidade estreptavidina, respectivamente. Um esquema de purificação por afinidade em tandem com Ni-NTA e cromatograf ia à base de estreptavidina inicialmente utilizado por Voigt et al. 7 é empregue para purificar homólogos de espécies assimétrica simétrico (Figura 1A). Oct�eros histonas assimétricos são utilizados posteriormente para reconstituir complexos nucleossomais equivalentes (Figura 1B), utilizando o método de diálise sal padrão 14. Além disso, através do mesmo procedimento e por ter uma das piscinas histona pré-modificados, um PTM pode ser incorporado de forma assimétrica para os nucleossomas resultantes. A reacção destes substratos com as enzimas modificadoras de histonas e subsequente RMN-mapeamento de eventos de modificação de permitir a caracterização dos mecanismos de diafonia, tanto em cis-(cópia histona premodified) e na trans-(unmodificópia Ed histona) (Figura 1C).

Protocol

1. Reconstituição de Nucleosomes com diferencialmente Isotope marcado (e assimetricamente Modificada) Irmã Histones NOTA: O protocolo atual descreve a reconstituição dos nucleossomos com diferencialmente H3 histona marcada com isótopos. Para este fim, foram utilizados dois conjuntos de histona H3; um N-15 foi rotulado e continha uma 6xHis-tag no terminal-N e a segunda foi de 13 C-rotulado e continha o péptido Strep (WSHPQFEK) fundido na extremidade N-termina…

Representative Results

Octam�ica espécies correctamente redobradas são isolados após uma corrida de reconstituição a mistura através de uma coluna de filtração em gel (Figura 2). A piscina octam�ica reconstituído contendo os três tipos diferentes de octâmeros é submetido ao esquema de purificação por afinidade em tandem. As amostras são recolhidas a partir de todas as etapas e analisadas por SDS-PAGE e subsequentemente WB. A verificação da correcta execução do prot…

Discussion

Para a reconstituição nucleossomo, o protocolo atual utiliza um modelo de DNA longo de 165 pb contendo o 601-Widom sequência posicionamento nucleosome 20, mas o desempenho semelhante é esperado usando vários comprimentos de modelos de DNA. O protocolo foi projetado e ao serviço que utilizam tipos assimétricos de histona H3. Com o mesmo princípio, o método pode ser aplicado também a outras histonas nucleares e, adicionalmente, pode ser utilizado para reconstituir os complexos que transpo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O autor agradece o Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlim) para fornecer espaço de wet-lab e infra-estrutura para realizar experimentos e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para financiar o trabalho através de uma bolsa de investigação (LI 2402 / 2-1).

Materials

Unfolding Buffer 7M guanidinium HCl
20mM Tris pH7.5
10mM DTT
Refolding Buffer 10mM Tris pH7.5
2M NaCl
1mM EDTA
2mM DTT
Assay Buffer 25mM NaxHxPO4 pH6.8
25mM NaCl
2mM DTT
Guanidinium HCl Applichem A14199 Use high quality Gu-HCl
Tris  Roth 4855.2
DTT Applichem A1101
NaCl VWR chemicals 27810.364
EDTA Roth 8043.2
Na2HPO4 Applichem A1046
NaH2PO4 Applichem A3902
Imidazole Applichem A1073
d-Desthiobiotin Sigma D1411
Ni-NTA Superflow Qiagen 1034557
Strep-Tactin Superflow IBA 2-1207-001
His-probe antibody Santa Cruz sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP IBA 2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200pg GE Healthcare 28-9893-35
6-8kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 1, 132650
50kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 7, 132129
10kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC901024
30kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC903024
Solution-state NMR spectrometer  at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe

References

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Cite This Article
Liokatis, S. Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones. J. Vis. Exp. (121), e55349, doi:10.3791/55349 (2017).

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