Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

Summary

Die kardiale biowire Plattform ist eine in vitro – Methode verwendet , um durch die Kombination von dreidimensionaler Zellkultivierung mit elektrischer Stimulation humanen embryonale und induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (HPSC-CM) zu reifen. Dieses Manuskript zeigt den detaillierten Aufbau der Herzens biowire Plattform.

Abstract

Humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (HPSC-CMs) haben eine viel versprechende Zellquelle und haben ermutigt, so die Untersuchung ihrer möglichen Anwendungen in der Herzforschung, einschließlich der Wirkstoffforschung, Krankheitsmodelle, Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Jedoch durch bestehende Protokolle produzierten Zellen zeigen eine Reihe von Unreife verglichen mit nativem Erwachsenen Kardiomyozyten. Viele Anstrengungen wurden unternommen, HPSC-CMs, mit nur mäßiger Reifung erreicht so weit zu reifen. Daher ist es ein engineered System, genannt biowire, wurde durch die Bereitstellung sowohl physikalische als auch elektrische Signale entwickelt HPSC-CMs zu einem reiferen Zustand in vitro zu führen. Das System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform HPSC-CMs in Kollagen Typ I entlang einer Naht starren Schablone gelieren zusammen in fluchtHerzGewebe (biowire) Samen, die mit einer progressiv ansteigenden Frequenz der elektrischen Feldstimulierung ausgesetzt wird. Im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen,stimulierte biowired einen verbesserten Reifegrad strukturellen und elektro Kardiomyozyten zeigen. Solche Änderungen sind abhängig von der Stimulationsrate. Dieses Manuskript beschreibt ausführlich die Gestaltung und Erstellung von biowires.

Introduction

Zell-basierte Therapie ist eine der vielversprechendsten und untersuchten Strategien Herz-Reparatur / Regeneration zu erreichen. Es wurde von Herz-Tissue Engineering und der Co-Lieferung von Biomaterialien ^{1, 2} unterstützt. Die meisten verfügbaren Zellquellen haben in Tiermodellen für ihre potenziell positiven Auswirkungen auf beschädigt, krank oder im Alter von Herzen ³ untersucht worden. Insbesondere haben erhebliche Anstrengungen humanen pluripotenten Stammzellen (HPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten (HPSC-CM), eine potentiell unbegrenzte autologe Zellquelle für Herz-Tissue Engineering verwenden gemacht worden. HPSC-CMs kann mit mehreren etablierten Protokollen ⁴ hergestellt ^{werden, 5, 6.} Die erhaltenen Zellen fötale artige Phänotypen darstellen, mit einer Reihe von unreifen Eigenschaften im Vergleich zu erwachsenem ventrikulären Kardiomyocyten jedoch, ^7, </sup> ^8. Dies kann ein Hindernis für die Anwendung von HPSC-CMs als Modelle von adulten Herzgeweben in der Wirkstoffforschung und in der Entwicklung von adulten Herzkrankheitsmodellen ⁹ sein.

Um diese Einschränkung der phänotypischen Unreife zu überwinden, werden neue Ansätze wurden Kardiomyozyten Reifung zu fördern aktiv untersucht. Frühe Studien zeigten wirksame pro-Reifungseigenschaften in neonatalen Ratten – Kardiomyozyten über zyklische mechanische oder elektrische Stimulation ^{10 11.} Gel Kompaktierung und zyklische mechanische Stimulation wurden ebenfalls ¹² einige Aspekte der HPSC-CM Reifung verbessern ^{gezeigt, 13,} mit minimaler Verstärkung der elektrophysiologischen und Calcium Handhabungseigenschaften. Daher wurde durch die Bereitstellung sowohl strukturelle Cues und elektrisches Feld stimulatio ein Plattformsystem „biologische wire“ (biowire) genannt erdachtn die Reifung von HPSC-CMs ¹⁴ zu verbessern. Dieses System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform ausgerichtet Herzgewebe zu schaffen, das auf elektrische Feldstimulation zugänglich ist. Dies kann dazu verwendet werden, um die strukturelle und elektroLaufZeit von HPSC-CMs zu verbessern. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer solchen biowires machen.

Protocol

1. Master Design und Herstellung HINWEIS: Verwenden Sie weiche Lithographie zur Herstellung von Bauelementen. Machen einen zweischichtigen SU-8-Master für Polydimethylsiloxan (PDMS) Guß. Gestalten Sie das Gerät mit einem Design und Erstellung von Software (Abbildung 1A, links). Zeichnen jede Schicht des Master getrennt. Drucken der Vorrichtungskonstruktion auf zwei Photomasken bei 20.000 dpi, entsprechend den beiden Schichten des Master 15.</s…

Representative Results

Das rationale für die Verwendung einer Naht in den Biowires dient als Vorlage für die Bildung von 3D-Konstrukten, die sich in einer Achse ausrichten und die Form von Herzfasern nachahmen. Wir zeigen, dass nach sieben Tagen Kultur im Biowire die Zellen das Gel um die Naht umgebaut haben (Abbildung 3A ). Die Zellen versammelten sich entlang der Achse der Naht, um ausgerichtetes Herzgewebe zu bilden (Abbildung 3 ). Nach 7 Tagen Vorkultur wurden die Biowir…

Discussion

Dieses Manuskript beschreibt die Einrichtung und Durchführung der konstruierten Plattform, biowire, die Reifung von HPSC-CMs zu verbessern. Das Gerät kann in Standard-Mikrofabrikationsanlagen hergestellt werden und kann mit biowires gemeinsamen Zellkulturtechniken und einem elektrischen Stimulator erzeugt werden.

Unseres Wissens gibt es keine berichtete ähnliches Verfahren wie biowires. Diese Strategie zeigt, dass eine verbesserte Reifungseigenschaften auf der elektrischen Stimulationsreg…

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin