Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции

Summary

Сердца biowire платформа является методом в пробирке используется для зрелых человеческих эмбриональных и индуцированных клеток , полученных кардиомиоцитов плюрипотентных стволовых (HPSC-CM) путем объединения трехмерного культивирования клеток с электрической стимуляцией. Эта рукопись представляет подробную установку сердечной biowire платформы.

Abstract

Человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоциты (HPSC-КМВ) был многообещающим источником клеток и таким образом поощрять исследование их потенциальных применений в сердечной исследований, в том числе открытия новых лекарств, моделирование болезни, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Однако, клетки, полученные существующими протоколами показывают диапазон незрелости по сравнению с носителями взрослых желудочковых кардиомиоцитов. Много усилий было сделано, чтобы созреть HPSC-КМВ, с умеренным созревании достиг до сих пор. Таким образом, разработано система, названная biowire, была разработана путем предоставления как физические и электрических сигналов , чтобы привести HPSC-CMs к более зрелому состоянию в пробирке. Система использует платформу микроизготовленной семени HPSC-CMs в коллагене типа I гелеобразованию вдоль жесткого шаблона шовного материала, чтобы собрать в выровненную ткань сердца (biowire), который подвергается воздействию электрического поля стимуляции с постепенно возрастающей частотой. По сравнению с нестимулированным управлением,стимулировал biowired кардиомиоцитов проявляют повышенную степень структурного и электрофизиологического созревания. Такие изменения зависят от скорости стимуляции. Эта рукопись подробно описывает конструкцию и создание biowires.

Introduction

Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных и исследуемых стратегий для достижения сердца ремонта / восстановления. Это было облегчено инженерии сердечной ткани и совместной доставки биоматериалов ^{1, 2.} Большинство доступных источников клеток, были изучены на животных моделях для их потенциально благотворное воздействие на поврежденные, больные, или престарелыми сердца ^3. В частности, значительные усилия были предприняты, чтобы использовать человеческие плюрипотентные стволовые клетки (HPSC) -derived кардиомиоцитов (HPSC-CM), потенциально неограниченный источник аутологичных клеток для инженерии сердечной ткани. HPSC-МС может быть получен с использованием нескольких установленных протоколов ^{4, 5, 6.} Однако полученные клетки обладают эмбриональными-подобными фенотипами, с диапазоном незрелых характеристик по сравнению со взрослыми желудочковых кардиомиоцитов ^7, </sup> ^8. Это может быть препятствием для применения HPSC-CMs в качестве моделей взрослой ткани сердца в исследовании обнаружения наркотиков и в развитии взрослых сердечных моделей заболеваний ^9.

Для того, чтобы преодолеть это ограничение фенотипической незрелости, новые подходы активно исследуются в целях содействия кардиомиоцитов созреванию. Ранние исследования показали , эффективные свойства про-созревания в неонатальных кардиомиоцитов крыс с помощью циклического механического ¹⁰ или электрической стимуляции ^11. Гель для уплотнения и циклическое механическое раздражение также показали , чтобы улучшить некоторые аспекты HPSC-CM созревания ^{12, 13,} с минимальным усилением электрофизиологических и кальцием свойств обработки. Таким образом, система платформы называется «биологическая провод» (biowire) была разработана путем предоставления как структурных сигналов и электрическое поле stimulatioп для повышения созревания HPSC-МС ^14. Эта система использует микроизготовленную платформу для создания выровненной сердечной ткани, которая поддается электрической стимуляция поля. Это может быть использовано для улучшения структурных и электрофизиологические зрелостей HPSC-CMs. Здесь мы описываем деталь изготовления такого biowires.

Protocol

1. Мастер Дизайн и изготовление Примечание: Используйте мягкую литографию для изготовления устройства. Сделать двухслойные мастер в SU-8 для полидиметилсилоксана (PDMS) под давление. Конструкция устройства с помощью проектирования и черчения программного обеспечени…

Representative Results

Рациональное для использования шовного материала в biowires, чтобы служить в качестве шаблона для формирования 3D-конструкций, которые выравнивают на одной оси, и имитируют форму сердечных волокон. Показано , что после семи дней культивирования в biowire, клетка перестроенно?…

Discussion

Эта рукопись описывает установку и внедрение спроектированной платформы, biowire, чтобы улучшить созревание HPSC-CMs. Устройство может быть выполнено в стандартных объектах микрообработки, и biowires может быть получен с обычными методами клеточной культуры и электрическим стимулятором.

<p clas…

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin