Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.
Abstract
Quantifizierung von Muskelfaserpopulationen stellt einen tieferen Einblick in die Auswirkungen der Krankheit, Trauma und verschiedene andere Einflüsse auf die Skelettmuskelmasse. Verschiedene zeitaufwendige Verfahren sind traditionell verwendet worden, Faserpopulationen in vielen Bereichen der Forschung zu studieren. Doch vor kurzem immunhistochemischen Methoden basierend auf Myosin Proteinexpression bietet eine schnelle Alternative entwickelt, um mehrere Fasertypen in einem einzigen Abschnitt zu identifizieren. Hier präsentieren wir ein schnelles, zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll für eine verbesserte Qualität der Färbung, so dass die automatische Erfassung ganzer Querschnitt und die automatischen Quantifizierung von Faserpopulationen mit ImageJ. Zu diesem Zweck werden eingebettete Skelettmuskulatur in Querschnitte geschnitten, gefärbt unter Verwendung von schweren Myosinketten der Antikörper mit fluoreszierenden sekundären Antikörper und DAPI für Zellkerne Färbung. Ganze Querschnitte werden dann hochauflösendes Verbund automatisch über einen Schiebe Scanner gescannt zu erhaltenBilder der gesamten Probe. Faserpopulation Analysen werden anschließend langsam, mittel und schnell Fasern unter Verwendung eines automatisierten Makro für ImageJ ausgeführt zu quantifizieren. Wir haben zuvor gezeigt, dass diese Methode Populationen Faser identifizieren kann zuverlässig auf ein Maß von ± 4%. Darüber hinaus reduziert diese Methode inter Benutzer Variabilität und Zeit pro signifikant die Open-Source-Plattform ImageJ Analysen mit.
Introduction
Skelettmuskelmasse erfährt tiefe Veränderungen während der physiologischen Prozesse , wie Alter 1, 2, Aufgabe 3, 4, 5, 6, 7 oder pathophysiologische Prozesse wie Krankheit 8, 9, 10 oder 11 Trauma. mehrere Forschungsfelder konzentrieren sich auf die strukturellen Auswirkungen dieser Prozesse daher zu funktionellen Veränderungen zu verstehen. Einer der wichtigsten Aspekte der Muskelfunktion bestimmt, ist die Zusammensetzung der Muskelfasern. Muskelfasern exprimieren verschiedene Myosin schwere Kette (MHC) -Proteinen und dadurch klassifiziert in langsam, mittel oder schnell Fasern 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Physiologisch haben Muskeln unterschiedliche Muskelfaserzusammensetzungen in Abhängigkeit von ihrer Funktion im Körper. Verwendung von Muskelfasern Typisierung, Faserpopulationen kann quantifiziert werden 7 Anpassung an physiologische oder pathophysiologische Prozesse zu identifizieren, 17. Historisch gesehen, wurde zwischen den Muskelfasertypen zu unterscheiden, eine Anzahl von zeitraubenden Methoden angewandt. Zu diesem Zweck wurde Muskelfasern entweder bei verschiedenen pH-Werten oder Muskelenzymaktivität durch die Reaktivität von Myosin ATPase eingestuft. Da unterschiedliche Faserqualitäten nicht in einem einzigen Abschnitt, mehrere Querschnitte erforderlich waren , bewertet werden könnten alle Muskelfasern zu identifizieren und 14 manuelle Quantifizierung ermöglichen, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Im Gegensatz dazu verwendeten jüngste Veröffentlichungen Immunhistochemie (IHC) gegen Myosin schweren Kette-Protein kodiert, um schnell mehrere Fasertypen in einer einzelnen Querschnitte beflecken. Auf der Grundlage der Vorteile dieses Verfahrens ist es nun der Goldstandard in der Muskelfaserpopulationsanalyse betrachtet 19, 23, 24. Mit verbesserten IHC Färbeprotokollen, waren wir, dass die vollautomatische Erfassung ganzer Muskelquerschnitt und die anschließenden Faser Quantifizierung automatischer Muskels zu zeigen, vor kurzem der Lage möglich ist, die Open-Source-Plattform ImageJ. Im Vergleich zu manueller Quantifizierung, vorausgesetzt unser Verfahren eine signifikante Abnahme in der Zeit (etwa 10% der manuellen Analysen) erforderlich pro Folie während genauer wobei 4% bis ± 25 </sup>.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle, zuverlässige, benutzerunabhängige Anleitung zur automatischen Muskelfaser Quantifizierung in ganzen Ratten Muskeln unter Verwendung einer Open-Source-Plattform zu beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir mögliche Änderungen, die seine Verwendung für andere Proben wie Mäuse oder menschliche Muskeln erlauben würden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methodik zu studieren und automatisch die Muskelfaser Populationen von Ratten Querschnitt über die Immunhistochemie in einer Zeit effiziente Art und Weise zu quantifizieren. Für Reproduzierbarkeit präsentieren wir einen detaillierten Schritt für Schritt erklärt und mögliche Modifikationen für Anwendungen in anderen Arten, die nicht in dieser Studie beschrieben. Darüber hinaus diskutieren wir die Vorteile des Verfahrens, Voraussetzungen für eine optimale Funktion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Christian Doppler Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir möchten, dass Sabine Rauscher von der Core Facility Imaging an der Medizinischen Universität Wien, Österreich für die Unterstützung während des gesamten Projektes danken. Primäre Antikörper wurden von Schiaffino, S. entwickelt, erhalten von der Entwicklungs Studies Hybridoma Bank durch die NICHD des NIH erstellt und an der University of Iowa, Fachbereich Biologie, Iowa City, IA gehalten.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
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