Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.
Abstract
La quantificazione delle popolazioni di fibra muscolare fornisce una più profonda comprensione degli effetti di malattie, traumi, e varie altre influenze sulla composizione del muscolo scheletrico. Vari metodi in termini di tempo sono stati tradizionalmente usati per studiare le popolazioni di fibra in molti campi della ricerca. Tuttavia, recentemente sviluppato metodi immunoistochimici basati su proteine espressione della catena pesante della miosina fornire una rapida alternativa per identificare i tipi di fibre multiple in una singola sezione. Qui, vi presentiamo un protocollo rapido, affidabile e riproducibile per migliorare la qualità della colorazione, consentendo l'acquisizione automatica di profilati trasversali interi e quantificazione automatica delle popolazioni fibra con ImageJ. A questo scopo, i muscoli scheletrici incorporati sono tagliati in sezioni, colorati con miosina catene pesanti anticorpi con anticorpi fluorescenti secondarie e DAPI per nuclei delle cellule colorazione. intere sezioni trasversali vengono esaminati automaticamente utilizzando uno scanner diapositiva per ottenere alta risoluzione compositole fotografie dell'intera campione. analisi demografiche fibra vengono successivamente eseguite per quantificare fibre lente, intermedie e rapide utilizzando una macro automatizzato per ImageJ. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo può identificare popolazioni di fibre in modo affidabile ad un grado di ± 4%. Inoltre, questo metodo riduce la variabilità inter-utente e tempo per analisi significativamente utilizzando la piattaforma open source ImageJ.
Introduction
Composizione muscolo scheletrico subisce profonde modificazioni durante i processi fisiologici quali l'invecchiamento 1, 2, 3 esercizio, 4, 5, 6, 7, o processi patofisiologici come il morbo 8, 9, 10 o 11 trauma. Quindi, diversi campi di concentrato di ricerca sugli effetti strutturali di questi processi per capire i cambiamenti funzionali. Uno degli aspetti chiave che determinano la funzione muscolare è la composizione delle fibre muscolari. Fibre muscolari esprimono catena pesante proteine differente miosina (MHC) e sono quindi classificate in lento, intermedi, o veloce fibre 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fisiologicamente, muscoli hanno differenti composizioni di fibre muscolari a seconda della loro funzione nel corpo. Utilizzando fibre muscolari digitazione, le popolazioni di fibre possono essere quantificati per identificare adattamento a processi fisiologici o patofisiologici 7, 17. Storicamente, sono stati applicati vari metodi richiedono tempo per distinguere tra tipi di fibra muscolare. A questo scopo, le fibre muscolari erano classificati mediante reattività della miosina ATPasi a diversi livelli di pH o enzima attività muscolare. Come differente qualità di fibra non può essere stabilita in una singola sezione, sezioni multiple sono stati richiesti per identificare tutte le fibre muscolari e permettere manuale quantificazione 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Al contrario, recenti pubblicazioni usati immunoistochimica (IHC) contro proteina miosina catena pesante di macchiare rapidamente tipi di fibre multiple in un singolo sezioni trasversali. Sulla base dei vantaggi di questa procedura, è ora considerato il gold standard per l'analisi della popolazione fibre muscolari 19, 23, 24. Utilizzando migliorate protocolli di colorazione IHC, recentemente siamo stati in grado di dimostrare che l'acquisizione completamente automatica delle sezioni trasversali muscolo intero e successiva quantificazione automatica fibra muscolare è possibile utilizzando la piattaforma open source ImageJ. Rispetto alla quantificazione manuale, la nostra procedura prevista una significativa diminuzione del tempo (circa il 10% di manuale analisi) richiesto per vetrino pur essendo precisione di ± 4% 25 </sup>.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una guida rapida, affidabile, facile da indipendente quantificazione automatica fibra muscolare nei muscoli interi di ratto utilizzando una piattaforma open source. Inoltre, si descrivono i potenziali modifiche che avrebbero permesso il suo utilizzo per altri campioni, come topi o muscoli umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare e quantificare le popolazioni di fibre muscolari di sezioni trasversali di ratto mediante immunoistochimica in modo efficiente tempo automaticamente. Per la riproducibilità, presentiamo un passo dettagliate descrizione passo e potenziali modifiche per applicazioni in altre specie non descritte in questo studio. Inoltre, si discute i vantaggi del procedimento, prerequisiti per la funzione ottimale e suoi limiti.
Attua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Christian Doppler Research. Vorremmo ringraziare Sabine Rauscher dal Nucleo strumento Imaging presso l'Università di Medicina di Vienna, Austria per il supporto durante tutto il progetto. Gli anticorpi primari sono stati sviluppati da Schiaffino, S., ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta a L'University of Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
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