Summary

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Published: April 03, 2017
doi:

Summary

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Abstract

A obesidade promove um estado inflamatório crônico que em grande parte é mediado por macrófagos de tecido-residente, bem como macrófagos derivados de monócitos. Obesidade induzida por dieta (DIO) é um modelo valioso em estudar o papel da heterogeneidade de macrófagos; no entanto, os isolamentos adequados macrófago são difíceis de adquirir de tecidos inflamados. Neste protocolo, descrevem as etapas de isolamento e necessárias diretrizes de solução de problemas derivadas de nossos estudos para a obtenção de uma população adequada de tecido-residente de macrófagos de ratos após 18 semanas de alto teor de gordura (HFD) ou gordura/alta-colesterol ( Intervenção de dieta HFHCD). Este protocolo incide sobre três tecidos de hallmark estudados na obesidade e aterosclerose, incluindo o fígado, os tecidos de adiposo brancos (WAT) e a aorta. Destacamos o uso como dualista de fluxo cytometry pode alcançar uma nova dimensão de isolamento e caracterização de macrófagos de tecido-residente. Uma seção fundamental do presente protocolo aborda a complexidade subjacente digestões enzimáticas de tecido-específica e isolamento do macrófago e subsequente da pilha-superfície anticorpo mancha para análise de fluxo cytometric. Este protocolo aborda existentes complexidades subjacentes fluorescente-ativado da pilha (FACS) de classificação e apresenta esclarecimentos para essas complexidades a fim de obter a caracterização de ampla gama de populações de células adequadamente classificada. Métodos alternativos de enriquecimento estão incluídos para classificação de células, tais como o fígado densa, permitindo a gestão de tempo e flexibilidade quando se trabalha com FACS. Em breve, este protocolo auxilia o pesquisador para avaliar a heterogeneidade de macrófagos de uma infinidade de tecidos inflamados em um determinado estudo e fornece dicas de solução de problemas perspicazes que foram bem sucedidas para caracterização e isolamento celular favorável de células do sistema imunológico em inflamação mediada por DIO.

Introduction

Modelos de mouse têm sido extensivamente usados para estudar a dinâmica de doenças humanas. Isolamento adequado, residente de células de tecidos de ratos em um estado doente pode fornecer uma plataforma para a compreensão das contribuições moleculares e celulares para a patogênese de uma doença1. Uma doença que é de importância crucial é a obesidade. A incidência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo em paralelo com a resistência à insulina e o tipo 2 diabetes mellitus, doença cardiovascular e esteatose hepática2,3. Consumo excessivo de nutrientes é ainda mais distorcido pela diminuição da atividade física, desencadeando alterados sinais provenientes do tecido adiposo, o que pode alterar o meio celular de outros tecidos periféricos como a aorta e fígado4. Tal rompimento da homeostase metabólica resulta em uma crônica de baixo grau de inflamação sistêmica5.

Clássica ativação de macrófagos residentes para a aorta e fígado, bem como o recrutamento para o tecido adiposo branco (WAT) tem demonstrada não só iniciar dysregulation do metabólicos sinais mas também sustentar inflamação6,7. A heterogeneidade fenotípica e funcional de macrófagos é fortemente associada com a patogênese da obesidade relacionada co-morbidades7. A plasticidade dinâmica na polarização do macrófago permite que estas células que exibem uma variedade de fenótipos registrados que coordenam a progressão e a resolução da inflamação8. Enquanto classicamente ativados macrófagos (M1) estão implicados na propagação da inflamação, alternativamente ativados macrófagos (M2) foram associados com resolução e tecido reparação9,10.

Como o corpo sofre estresse metabólico, o tecido adiposo branco anormalmente acumula. O tecido adiposo expandido atrai e retém células inflamatórias que alterar profundamente a função normal dos adipócitos para promover a resistência à insulina, hiperglicemia e, finalmente, diabetes mellitus tipo 2, resistência à insulina ou hiperglicemia11, 12. Em paralelo, tecido adiposo branco remodela em resposta a sinais inflamatórios lançado pela infiltrou-se classicamente registrados (M1) tecido adiposo macrófagos (ATMs)13,14. Este órgão multicelular exerce uma cascata de sinais que desvia a função normal de outros órgãos do corpo tais como a aorta e hepática4.

O fígado é uma potência metabólica que adapta-se em resposta aos estímulos provenientes da vizinha desregulação WAT15. Hepáticos macrófagos ou células de Kupffer, em resposta a alterações metabólicas, secretam citocinas inflamatórias que transformam ambos parenquimatosa e fenótipo de células não-parenquimatosas e promovem a remodelação do tecido. Acúmulo de lipídios hepático, inflamação, depósitos excessivos de matriz extracelular, necrose e função eventual perda segue os insultos inflamatórios, contribuindo para o amplo espectro de danos no fígado associados com doença hepática gordurosa não-alcoólica 16,17,18.

Em paralelo a WAT comprometido e função hepática, grandes artérias acumulam lipídios dentro da parede arterial como o corpo sofre de estresse metabólico crônico19. Acúmulo de lipídios arterial desencadeia a secreção de quimiocinas pelas células endoteliais ativadas e subsequente recrutamento de monócitos20. Uma vez recrutados, monócitos proliferam, diferenciam, ingerem lipoproteínas e tornar-se células de espuma. Atherogenesis é iniciada e sustentada pela atividade pró-inflamatória dos recrutados e macrófagos residentes tecido de lipídios-carregados. Sucumbir a sinais de estresse extracelular e intracelular, retransmitidos neste microambiente aterogênico, esses macrófagos então se envolver em uma cascata de sinalização de apoptotic. Como essas células espuma morrem, eles contribuem seu conteúdo lipídico preenchido para o núcleo necrótico da lesão, que então leva a ruptura da placa, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.

Coletivamente, a heterogeneidade dos fenótipos de macrófagos em parte organiza a obesidade induzida por alterações inflamatórias observadas nos tecidos de desregulação como WAT, fígado e aorta8,21. Caracterização de recrutados e macrófagos residentes tecido poderiam fornecer insights sobre potenciais alvos moleculares que manipulam o macrófago fenótipo1. Para efetivamente caracterizar os macrófagos dos tecidos inflamados induzida pela obesidade, uma suspensão de célula única pode ser obtida através de digestão enzimática. Esses protocolos de dissociação devem ser eficazes em suficientemente degradante do tecido conjuntivo, minimizando a morte celular imune e oferece um rendimento de célula ideal. A mistura de enzima é dependente do tipo de tecido e seu tornar-se estrutural. Tecidos resistentes, tais como a aorta requer mais forte atividade enzimática, em comparação com o fígado e o WAT, para alcançar a dissociação de tecido. Da suspensão de célula única, macrófagos residentes de tecido podem ser inequivocamente caracterizados ou isolados para ainda mais a jusante análises tais como criação de perfil transcricional.

Aqui um protocolo específico de tecido é descrito que usa tecido dependente de colagenase digestão e citometria de fluxo policromático efetivamente isolar e caracterizar macrófagos residentes tecido obtidos de obesidade dieta tradicional induzida, aterosclerose, simples esteatose e esteatohepatite mouse modelos. Simultânea de coloração de marcadores de superfície celular com anticorpos contra leucócitos-(CD45 e/ou CD11b) e macrófago – antígenos específicos (F4/80) é frequentemente usado para identificar as populações de macrófagos22. Fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é uma poderosa estratégia usada para classificar essas populações identificadas em elevado grau de pureza. População classificada, então, pode ser avaliada para perfis de fenótipo gene específico usando a jusante análise molecular (tais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa)23. Apesar de citometria de fluxo padrão e classificação de celulares baseados em citometria de fluxo são ferramentas poderosas na distinção entre macrófagos dentro de uma suspensão de células vastamente heterogêneos, os antigos protocolos devem ser otimizados para garantir uma saída bem sucedida. Neste estudo, são descritos os protocolos que efetivamente isolar e caracterizam os macrófagos específicos do tecido viável; mais importante, este estudo fornece insight crucial sobre questões técnicas que muitas vezes surgem, bem como estratégias proativas e resolução de problemas para prevenir e/ou resolvê-los.

Protocol

Todos os protocolos experimentais (seções 1, 1.2 e 1.3) foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) na Universidade Estadual da Pensilvânia. Tecido Preparação de Buffers de dissociação Volume final Armazenamento Tecido adiposo branco (WAT) Buffer de dissociação: 2,5% HE…

Representative Results

Ao usar o apolipoprotein E deficientes camundongos C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) mantidos em uma dieta de alta gordura colesterol elevado (HCHFD ou HCD) por 18 semanas, 1 x 104 – 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrófagos aórtico podem ser isolados quando duas amostras são em pool. Fígados dissecados de ratos alimentados com HFHCD KO ApoE, produziu maior que 5 x 105 classificados células de Kupffer (que depende do tempo de classificação disp…

Discussion

Modelos de desordem metabólica induzida por dieta que imitam co-morbidades, tais como aterosclerose, simples esteatose, esteatohepatite e diabetes tipo 2 são usados extensivamente para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes de progressão da doença. Digestão dependente de colagenase é muitas vezes usado para dissociar os tecidos para libertar as células da matriz extracelular (ECM)16,27. Enzimas como a colagenase perturbam o colágeno que …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a facilidade do núcleo citometria de fluxo para a Universidade de Pensilvânia estado Millennium ciência complexa.

Materials

26G x 5/8 in Needles BD 305115
23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1mL syringe with rubber stops BD 309659
10mL Syringes BD 309604
1mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 micron cell strainers Corning, Inc. 352350
 1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps  Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 micron Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

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