Summary

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Published: April 03, 2017
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Abstract

Obezite büyük ölçüde doku yerleşik makrofajlar gibi monosit kaynaklı makrofajlar tarafından aracılık ettiği kronik bir enflamatuar devlet teşvik etmektedir. Diyet kaynaklı obezite (DIO) makrofaj heterojenite rolü eğitim değerli bir modeldir; Ancak, yeterli makrofaj izolasyonların iltihaplı dokulara elde etmek zordur. Bu protokol için biz yalıtım adımları ve doku yerleşik makrofajlar uygun nüfusu yüksek yağlı (HFD) veya yüksek yağ/yüksek kolesterol (18 hafta takip fareler elde etmek için çalışmalarımız elde gerekli hata giderme kılavuzu anahat HFHCD) diyet müdahale. Bu iletişim kuralı obezite ve karaciğer, beyaz yağ dokuları (WAT) ve aort damarı da dahil olmak üzere ateroskleroz okudu üç hallmark dokular üzerinde duruluyor. Biz nasıl ikici kullanımı vurgulayın Akış Sitometresi yalıtım yeni bir boyut ve doku yerleşik makrofajlar karakterizasyonu elde edebilirsiniz. Bu iletişim kuralının temel bir bölümünü doku özgü Enzimatik sindirim ve makrofaj yalıtım ve akış sitometrik çözümlemesi için boyama sonraki hücre yüzeyine antikor temel inceliklerini giderir. Bu iletişim kuralı mevcut karmaşıklığı floresan aktif hücre (FACS) sıralama temel giderir ve geniş karakterizasyon yeterli sıralanmış hücre gruplarından elde etmek için bu karmaşıklığı için açıklamalar sunar. Alternatif zenginleştirme yöntemleri gibi FACS ile çalışırken esneklik ve zaman yönetimi için izin yoğun karaciğer hücreleri sıralamak için dahil edilir. Kısacası, bu iletişim kuralı çok sayıda belirli bir çalışma içinde iltihaplı doku makrofaj heterojenite değerlendirmek için araştırmacı yardımcıları ve olumlu hücresel yalıtım ve karakterizasyonu için başarılı olmuştur anlayışlı sorun giderme ipuçları sağlar iltihap DIO-aracılı bağışıklık hücrelerinin.

Introduction

Fare modelleri yoğun insan hastalıkları dinamiklerini incelemek için kullanılmaktadır. Fareler hastalıklı bir durumda doku yerleşik hücre uygun yalıtım Patogenez moleküler ve hücresel katkılar hastalığı1anlamak için bir platform sağlar. Kritik önemi olan bir obezite bozukluğudur. Obezite sıklığı 2 diyabet, kalp-damar hastalıkları ve yağlı karaciğer hastalığı2,3yazın ve insülin direnci ile paralel olarak dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Aşırı besin tüketimi daha da azalmış fiziksel aktivite olan aort ve karaciğer4gibi diğer periferik dokuların hücresel ortamı değiştirmek Yağ dokusundan kaynaklanan değişmiş sinyalleri tetikleyen tarafından çarpık. Bu tür bozulma metabolik homeostazı sonuçları bir kronik düşük dereceli sistemik inflamasyon5.

Klasik makrofajlar aorta ve karaciğer gibi beyaz Yağ dokusundan (WAT) onların işe alım için ikamet aktivasyonu sadece bozukluk metabolik sinyallerin başlatmak ama aynı zamanda iltihabı6,7sürdürmek için gösterilmiştir. Makrofajlar fenotipik ve fonksiyonel heterojen şiddetle obezite patogenezi ile ilişkilidir ilgili komorbiditeler7. Makrofaj polarizasyon dinamik plastisite bu hücreler bir dizi ilerleme koordine aktif fenotipleri ve inflamasyon8çözünürlüğe sergilemek sağlar. Klasik aktif (M1) makrofajlar iltihap yayılmasında karıştığı iken, alternatif olarak aktif (M2) makrofajlar çözünürlük ve doku onarımı9,10ile ilişkilendirilmiştir.

Vücudun metabolik stres uğrar gibi beyaz yağ dokusu anormal derecede birikir. Genişletilmiş yağ dokusu çeker ve derinden insülin direnci, hiperglisemi ve sonuçta tip 2 diabetes mellitus, insülin direnci veya hiperglisemi11tanıtmak için normal adipocyte işlevini değiştirme inflamatuar hücreleri korur, 12. Buna paralel olarak, beyaz yağ dokusu değişikler yanıt inflamatuar sinyalleri tarafından yayımlanan olarak klasik aktif (M1) yağ doku makrofajlar (TYS)13,14sızmış. Çok hücreli bu organ aort ve karaciğer4gibi diğer vücut organlarının normal fonksiyon raydan çıktı bir çağlayan sinyal yayıyor.

Karaciğer yakındaki dysregulated WAT15kaynaklanan uyaranlara yanıt olarak uyum sağlar metabolik bir elektrik santrali var. Hepatik makrofajlar veya Kupffer hücreleri, metabolik değişiklikler, hem parenkima dönüşümü inflamatuar sitokinlerin ve parenkimal olmayan hücre fenotip salgılar ve doku remodeling teşvik. Karaciğer lipid birikimi, iltihap, aşırı hücre dışı matriks mevduat, nekroz ve karaciğer hasarı geniş yelpazede katkıda inflamatuar hakaret non alkolik yağlı karaciğer hastalığı ile ilgili nihai işlev kaybı aşağıdaki gibidir 16,17,18.

Vücudun kronik metabolik stres19uğrar gibi güvenliği aşılan WAT ve karaciğer fonksiyon için paralel olarak büyük arterlerin lipidler Arteryel duvardaki içinde birikir. Arteryel lipid birikimi kemokinler aktive endotel hücreleri tarafından salgılanmasını ve monosit20sonraki işe alım tetikler. Bir kez işe, monosit çoğalırlar, ayırt etmek, lipoproteinler yutmayın ve köpük hücreleri haline. Atherogenesis başlatılan ve pro-inflamatuar etkinliği tarafından sürekli işe ve doku ikamet lipid yüklü makrofajlar. Bu aterojenik microenvironment geçirilen ekstraselüler ve hücre içi stres sinyallerini succumbing, bu makrofajlar sonra art arda sıralı sinyal bir apoptotik meşgul. Bu köpük hücreleri ölürken dolu lipid içeriklerini daha sonra plak rüptürü, miyokard enfarktüsü ve inme için neden lezyon nekrotik çekirdeğini katkıda bulunur.

Topluca, makrofaj fenotipleri heterojen kısmen enflamatuar degisimler WAT, karaciğer ve aort8,21gibi dysregulated dokularda gözlenen tarafından indüklenen obezite orchestrates. Karakterizasyonu işe ve ikamet makrofajlar doku makrofaj fenotip1işlemek potansiyel moleküler hedeflerin içgörü sağlayabilir. Etkili bir şekilde gelen obezite kaynaklı iltihaplı doku makrofajlar karakterize etmek için bir tek hücre süspansiyon Enzimatik sindirim elde edilebilir. Böyle ayrılma iletişim kurallarının yeterince bağ dokusu bağışıklık hücre ölümü en aza indirilmesi ve optimum hücre verim sağlayan aşağılayıcı içinde etkili olması gerekir. Enzim karışımı doku ve yapısal onun makyaj türüne bağlıdır. Aort damarı gibi esnek doku karaciğer ve WAT doku ayrılma elde etmek için kıyasla daha güçlü enzimatik aktivite gerektirir. Tek hücre süspansiyon, doku ikamet makrofajlar olabilir belirsizliğe yer bırakmadan ile karakterize veya transkripsiyon profil oluşturma gibi daha da aşağı akım analizleri için izole.

Burada bir doku özel iletişim kuralı etkin bir şekilde izole ve doku yerleşik makrofajlar indüklenen geleneksel beslenme obezite elde edilen karakterize için collagenase bağlı doku sindirim ve renkliden Akış Sitometresi kullanan anlatılan, ateroskleroz, basit yağlanma ve steatohepatitis fare modelleri. Eşzamanlı lökosit-(CD45 ve/veya CD11b) ve makrofaj – karşı antikor ile hücre yüzey işaretlerinin boyama (F4/80) belirli antijenleri kez makrofaj nüfus22tanımlamak için kullanılır. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama yüksek saflıkta, saptanan bu nüfus sıralamak için kullanılan güçlü bir stratejidir. Sıralanmış nüfus daha sonra aşağı akım moleküler analizi (gibi nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu)23kullanarak fenotip belirli bir gen profilleri için değerlendirilebilir. Standart Akış Sitometresi ve Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama makrofajlar içinde büyük ölçüde türdeş olmayan hücre süspansiyon ayrım içinde güçlü araçlar olmakla birlikte, eski protokoller başarılı çıkış sağlamak için optimize edilmiş olması gerekir. Bu çalışmada, etkili bir şekilde izole etmek ve uygun doku belirli makrofajlar karakterize protokolleri açıklanmıştır; daha da önemlisi, bu çalışmada, önlemek ve/veya bunları çözmek için proaktif ve LNB’ler stratejileri yanı sıra sık sık ortaya çıkan teknik sorunları içine çok önemli bilgiler sağlar.

Protocol

Tüm deneysel protokoller (Bölüm 1, 1.2 ve 1.3) kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Pennsylvania State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Doku Ayrılma arabellekleri hazırlık Son hacim Depolama Beyaz Yağ dokusundan (WAT) Ayrılma tampon: %2.5 HEPES, 10 mg/mL sığır serum album…

Representative Results

Apolipoprotein E eksik (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) fareler yüksek yağ yüksek kolesterol diyet (HCHFD veya HCD) 18 hafta, 1 x 104 – 2 x 104 CD45 tutulan kullanırken+F4/80+ ne zaman iki örnek aortik makrofajlar izole olabilir havuza alınmış. HFHCD beslenen ApoE KO fareler disseke ciğeri üretilen (ki mevcut sıralama zaman bağlıdır) 5 x 10 göre5 Kupffer hücreleri daha büyük. Ne zaman yüksek yağlı diyet (HFD) kullanarak be…

Discussion

Komorbiditeler ateroskleroz, basit yağlanma, steatohepatitis gibi taklit ve tip 2 diyabet diyet kaynaklı metabolik bozukluk modelleri temel moleküler mekanizmaları hastalık progresyon daha iyi anlamak için yaygın olarak kullanılır. Collagenase bağımlı sindirim genellikle doku hücreleri hücre dışı Matriks (ECM)16,27den kurtarmak için ayırmak için kullanılır. Collagenase gibi enzimler hücre komşu için yapısal destek sağlayan kolajen bozab…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Akış Sitometresi çekirdek tesis Pennsylvania State Üniversitesi Millennium bilim Complex adlı teşekkür etmek istiyorum.

Materials

26G x 5/8 in Needles BD 305115
23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1mL syringe with rubber stops BD 309659
10mL Syringes BD 309604
1mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 micron cell strainers Corning, Inc. 352350
 1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps  Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 micron Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  26. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
  27. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  28. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
  29. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  30. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
  31. Yu, Y. R. A., O’Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
  32. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
  33. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
  34. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  35. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
  36. Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
  37. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  38. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
  39. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
  40. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).

Play Video

Cite This Article
Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

View Video