Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
Bereiken axon regeneratie na zenuwstelsel letsel is een uitdagende taak 1. Het falen van axon regeneratie in het centrale zenuwstelsel (CZS) te bestuderen, hebben onderzoekers een overvloed aan zenuwbeschadiging modellen gebruikt. Als gebieden van het CNS verschillen, is het belangrijk om een anatomisch geschikt model om axon regeneratie te bestuderen. Met de juiste model kunnen onderzoekers een specifieke behandeling op basis van de ernst van de schade, de neuronale celtype en gewenste spinale kanaal ter beoordeling van regeneratie formuleren, in tegenstelling tot een "one-for-all" behandelingsstrategie.
In ruggenmergletsel, bijvoorbeeld de meest slopende symptomen voortkomen uit het verlies van gevoel en motoriek. Verlies van gevoel wordt veroorzaakt door schade aan de toenemende, sensorische paden, terwijl het verlies van beweging wordt veroorzaakt door schade aan de dalende motor paden. Als gevolg van cellulaire en anatomische verschillen tussen deze two paden, tal van gerichte axon regeneratie studies alleen gericht zijn op de ene of de andere route, met de grondgedachte dat succesvol herstel van één van enorm voordeel zou zijn voor patiënten. In dit artikel presenteren we een protocol dat rechtstreeks dorsale wortel ganglia (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortel verbrijzelingsletsel in het onderste cervicale ruggenmerg van een volwassen rat als een model voor zintuiglijke axon regeneratie studie gebruikt.
DRG sensorische neuronen verantwoordelijk zijn voor het doorgeven van sensorische informatie, zoals tactiele sensatie en pijn, van de periferie naar het centrale zenuwstelsel. De lange axonale uitsteeksels van sensorische neuronen in het ruggenmerg dienen als een goed model voor lange-afstand axon regeneratie te bestuderen. Bovendien, als knaagdieren een zintuiglijke route laesie kan overleven, zoals een dorsale wortel crush met een minimum aan welzijn complicaties, onderzoekers kunnen CNS axon regeneratie te bestuderen zonder de noodzaak om volledig laesie het ruggenmerg. Een viervoudige C5 – C8 (cervicaal level 5-8) dorsale wortel crush is aangetoond dat het een bruikbaar model voor voorpoot deafferentatie 2 zijn. Bovendien, een dorsale wortel crush verschaft een "schonere" model voor axon regeneratie te bestuderen van een directe ruggenmergletsel omdat het ongecompliceerd door andere factoren zoals gliale littekenvorming.
Het gebruik van virale gentherapie neuronen herprogrammeren in een regeneratieve toestand wordt in toenemende mate gezien als een veelbelovende behandelingsstrategie voor vele neurologische aandoeningen 3. Onderzoeken hebben de toepassing van een adeno-geassocieerd virus (AAV) vector die het transgen van een groeibevorderende eiwitten kunnen bereiken robuuste axon regeneratie met gedragsherstel 4, 5, 6 weergegeven. De schijnbare lage pathogeniciteit van AAV bij het opwekken van een immune respons en het vermogen om niet-delende cellen, zoals neuronen te transduceren, teHet optimale vector voor gentherapie. Bovendien wordt het recombinante AAV formulier voor therapie. In deze vorm is het niet in staat zijn virale genoom integreren in het gastheergenoom 7, waardoor het risico van insertie mutagenese in vergelijking met andere virale vectoren zoals lentivirussen. Dit maakt AAV een veilige keuze voor gentherapie toepassingen.
Als DRG bevat de cellichamen van sensorische neuronen, is de meest geschikte anatomische doelwit voor de toediening van virus voor gentherapie te onderzoeken en / of te bevorderen zintuiglijke axon regeneratie. In een onderzoek waarin verschillende AAV-serotypen en lentivirus, AAV serotype 5 (AAV5) bleek de meest efficiënte transductie DRG neuronen gedurende een tijdsverloop van ten minste 12 weken bij direct geïnjecteerd in de DRG 8 zijn. Bovendien kan AAV meer dan 40% transductie efficiëntie, transduceren alle DRG neuronale subtypes, zoals de grote diameter neurofilament 200 kDa(NF200) -positieve neuronen en de kleine-diameter calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) – of isolectin b4 (IB4) -positieve neuronen 4, 8.
Als de chirurgische procedure van DRG injectie en dorsale wortel te verpletteren letsel is zeer invasieve en delicaat, zijn wij van mening dat dit artikel zal helpen nieuwe gebruikers om de procedure te leren op een zeer efficiënte manier. In dit artikel tonen we representatieve resultaten uit volwassen ratten vier weken na de injectie van een controlevirus AAV5-GFP (green fluorescent protein) in C6 – C7 DRG's met een gelijktijdige C5 – C8 dorsale wortel verbrijzelingsletsel. Dit model is bijzonder geschikt voor onderzoekers die onderzoeken de toepassing van virale gentherapie zintuiglijke axon regeneratie te bevorderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel geven we een stap-voor-stap een DRG injectie en dorsale wortel verbrijzelingsletsel voeren in de onderste cervicale ruggenmerg van een volwassen rat. Aangezien dit is een zeer invasieve en delicate operatie, we raden alle potentiële gebruikers voldoende opleiding en de praktijk te verkrijgen alvorens naar dier chirurgie leven. De gebruikers moeten vertrouwd zijn, niet alleen met het ruggenmerg anatomie, maar ook met de omliggende spieren, wervel botstructuur en vaatstelsel zijn. Idealiter zou een bevoegd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Christopher Reeve Foundation en Dana, de Medical Research Council, de European Research Council ECMneuro, en de Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Wij willen graag onze diepste dank aan Heleen Merel van 't Spijker en Justyna Barratt uitspreken voor hun technische assistentie tijdens het filmen. We willen graag Dr Elizabeth Moloney en professor Joost Verhaagen (Nederland Instituut voor Neurowetenschappen) om te helpen bij AAV-productie.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
