Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
Axon Erreichen Regeneration nach Schädigung des Nervensystems ist eine anspruchsvolle Aufgabe 1. Um den Ausfall von Axonregeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) zu untersuchen, haben die Forscher eine Vielzahl von Nervenverletzungen Modelle verwendet. Als Regionen des ZNS unterscheiden, ist es wichtig, ein anatomisch geeignetes Modell zu studieren Axonregeneration zu verwenden. Durch das entsprechende Modell verwenden, können die Forscher eine spezifische Behandlung formulieren von der Schwere der Verletzung basiert, der neuronalen Zelltyp von Interesse und den gewünschten Rücken-Darm-Trakt Regeneration für die Beurteilung, im Gegensatz zu einer „One-for-all“ Behandlungsstrategie.
In Verletzung des Rückenmarks, zum Beispiel stammen die meisten schwächenden Symptome der Verlust der Empfindung und Fortbewegung. Verlust der Empfindung wird durch Schäden an den aufsteigenden sensorischen Bahnen verursacht, während der Verlust der Fortbewegung durch Schäden an den absteigenden motorischen Bahnen verursacht wird. Aufgrund zellulären und anatomischen Unterschiede zwischen diesen two Wege konzentrieren sich viele gezielte Axonregeneration Studien nur auf den einen oder anderen Weg, mit der Begründung, dass eine erfolgreiche Erholung der entweder von enormem Nutzen für die Patienten sein würde. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll, das eine direkte Spinalganglien (DRG) Injektion mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark einer erwachsenen Ratte als Modell Regeneration zu studieren sensorische Axonen verwendet.
DRG sensorisch Neuronen sind verantwortlich für die sensorischen Informationen, wie taktile Empfindung und Schmerzweiterleitung, von der Peripherie zum ZNS. Die langen axonale Projektionen von sensorischen Neuronen im Rückenmark dienen als ein gutes Modell Fern Axonregeneration zu studieren. Darüber hinaus, wie Nager eine sensorische Bahn Läsion wie ein dorsale Wurzel Quetschverletzungen mit minimalen Wohlergehen Komplikationen überleben können, können die Forscher CNS Axonregeneration studieren, ohne die Notwendigkeit vollständig in das Rückenmark zur Läsion. A Quadruple C5 – C8 (zervikale level 5 bis 8) dorsale Wurzel Quetschverletzungen wurde ein nützliches Modell für forepaw Deafferentation 2 gezeigt werden. Darüber hinaus bietet ein dorsales Wurzel Quetschverletzungen ein „sauberes“ Modell Axonregeneration als eine direkte Verletzung des Rückenmarks zu studieren, weil sie durch andere Faktoren wie Glia Narbenbildung unkompliziert.
Die Verwendung von viralen Gentherapie Neuronen in einem regenerativen Zustand neu zu programmieren zunehmend als vielversprechende Behandlungsstrategie für viele neurologische Erkrankungen 3 angesehen. Studien haben die Anwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektor trägt das Transgen eines wachstumsförderndes Protein gezeigt , mit Verhaltensbesserung 4, 5, 6 robust Axonregeneration erzielen. Die scheinbare niedrige Pathogenität von AAV in Hervorrufen einer Immunantwort und die Fähigkeit, sich nicht teilende Zellen transduzieren, wie Neuronen, machenes der optimale Vektor für die Gentherapie. Zusätzlich wird die rekombinante AAV Form zur Therapie verwendet. In dieser Form ist er unfähig , seine viralen Genoms in das Wirtsgenom zu integrieren , 7, um das Risiko von Insertionsmutagenese zu reduzieren , im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, wie Lentivirus. Dies macht AAV eine sichere Wahl für gentherapeutische Anwendungen.
Als DRG die Zellkörper von sensorischen Neuronen enthält, ist es das am besten geeignete anatomische Ziel für die Verabreichung des Virus für die Gentherapie zu untersuchen und / oder sensorische Axonregeneration zu fördern. In einer Studie wurde verschiedene AAV – Serotypen und Lentivirus, AAV – Serotyp 5 (AAV5) Vergleichen gezeigt in DRG – Neuronen transduzieren über einen Zeitverlauf von mindestens 12 Wochen die effizienteste, wenn 8 direkt in den DRG injiziert. Zusätzlich kann AAV mehr als 40% Transduktionseffizienz erreichen, alle DRG neuronalen Subtypen Umwandlungs, wie mit dem großen Durchmesser Neurofilament 200 kDa(NF200) -positiven Neuronen und der kleine Durchmesser Calcitonin gene-related peptide (CGRP) – oder isolectin b4 (IB4) -positiven Neuronen 4, 8.
Da das chirurgische Verfahren der DRG-Injektion und Quetschverletzungen dorsalen Wurzel extrem invasiv und empfindlich ist, sind wir der Meinung, dass dieser Artikel neue Benutzer helfen wird, das Verfahren auf eine sehr effiziente Art und Weise zu lernen. In diesem Artikel zeigen wir repräsentative Ergebnisse von erwachsenen Ratten vier Wochen nach der Injektion eines Kontrollvirus AAV5-GFP (green fluorescent protein) in C6 – C7 DRGs mit einem gleichzeitigen C5 – C8 dorsaler Wurzel Zu. Dieses Modell eignet sich besonders für Forscher, die die Verwendung von viralen Gentherapie untersuchen zu sensorischen Axonregeneration zu fördern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung eine DRG Injektion und dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark eines erwachsenen Ratte durchzuführen. Da dies eine sehr invasive und empfindliche Operation ist, empfehlen wir dringend, dass alle potentielle Anwender vor vorrückenden ausreichende Ausbildung und Praxis erhalten Tierchirurgie zu leben. Der Anwender sollte nicht nur mit Rückenmark Anatomie, sondern auch mit der umgebenden Muskelgewebe, Wirbelknochenstruktur und Gefäße ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Christopher und Dana Reeve Foundation, dem Medical Research Council, der European Research Council ECMneuro und der Cambridge NHMRC Biomedical Research Center unterstützt. Wir möchten unsere tiefste Dankbarkeit ‚zu Heleen Merel van während der Dreharbeiten t Spijker und Justyna Barratt für ihre technische Unterstützung zum Ausdruck bringen. Wir möchten, dass Dr. Elizabeth Moloney und Professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) zur Unterstützung bei AAV-Produktion danken.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
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