فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.
Abstract
النقل نوكليوسيتوبلازميك يشير إلى استيراد وتصدير جزيئات كبيرة من نواة الخلية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عددا من الدراسات وجود صلة بين التصلب الجانبي الضموري (ألس) والإعاقات في مسار نوكلوسيتوبلاسميك. ألس هو مرض تنكس عصبي يؤثر على الخلايا العصبية الحركية مما يؤدي إلى الشلل، وفي نهاية المطاف في الموت، في غضون 2-5 سنوات في المتوسط. معظم حالات ألس متقطعة، تفتقر إلى أي ارتباط وراثي ظاهر، ولكن 10٪ موروثة بطريقة مهيمنة. في الآونة الأخيرة، تم تحديد التوسعات تكرار هيكسانوكليوتيد (هريس) في كروموسوم 9 إطار القراءة المفتوحة 72 (C9orf72) الجينات كسبب وراثي ألس والخرف الصدغي الصدغي (فتد). الأهم من ذلك، وقد اقترحت مجموعات مختلفة مؤخرا أن هذه المسوخ تؤثر على النقل نوكلوسيتوبلاسميك. وقد أظهرت هذه الدراسات في الغالب النتيجة النهائية والمظاهر التي تسببها هرس على النقل نوكلوسيتوبلاسميك، لكنها لا تظهر اختلال النقل النووي فيفي الوقت الحالى. ونتيجة لذلك، يمكن تحديد فقط نقص نقل نوكلوسيتوبلاسميك شديد، ويرجع ذلك أساسا إلى أوفيركسريسيون عالية أو الإدراج البروتين خارجي.
يصف هذا البروتوكول مقايسة جديدة وحساسة جدا لتقييم وتحديد الاختلال النقل نوكلوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. معدل استيراد البروتين نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) يمكن أن يكون كميا في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلورسنت. ويتم ذلك باستخدام مثبط إكسبورتين، مما يسمح للمكوك غفب فقط لدخول النواة. للتحقق من الفحص، و C9orf72 ترجمة حقوق الإنسان ترجمة يتردد الببتيد، بولي (غر) وبولي (بيأر)، والتي تم عرضها سابقا لتعطيل النقل نوكلوسيتوبلاسميك، استخدمت. باستخدام الفحص الموصوف، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في معدل الواردات النووية مقارنة مع السيطرة. وباستخدام هذا النظام، يمكن فحص التغيرات الدقيقة في النقل النوكلوسيتوبلازمي وقدرة العوامل المختلفة على إنقاذ (ولو جزئيا) تر نوكليوسيتوبلازمييمكن تحديد عيب أنسبورت.
Introduction
مجمع المسام النووي (مجلس الشعب) يسيطر على استيراد وتصدير جزيئات كبيرة داخل وخارج نواة الخلية. وعلى النقيض من الجزيئات الصغيرة، التي يمكن أن تدخل النواة دون تنظيم 1 ، يتم التحكم في نقل الجزيئات الكبيرة بقوة من قبل المجلس الوطني. هذه الجزيئات الكبيرة، مثل البروتينات و الحمض النووي الريبي، المرتبطة بعوامل النقل، بما في ذلك الاستيراد والتصدير، ليتم استيرادها وتصديرها من النواة 2 . من أجل استيرادها، يجب أن تحتوي البروتينات على عزر الببتيد الصغير، وتسمى عموما إشارة توطين النووية (نلس)، التي ترتبط باستيراد 2 . هذه تسلسل من الأحماض الأمينية بمثابة علامة ومتنوعة في تكوين 3 ، 4 . يمكن تصدير البروتينات من النواة إلى السيتوبلازم بسبب ارتباطها مع إكسبورتينs، التي تربط تتابع إشارة، تسمى عموما إشارة تصدير نووية (نيس) 2 . كل من المستوردين والتصدير قادرون على نقل حمولتهم بسبب تنظيم راس الصغيرة ذات الصلة البروتين النووي غتباز (ران) 2 . وقد تبين أن ران موجودة في حالات مطابقة مختلفة اعتمادا على ما إذا كانت ملزمة إلى غتب أو الناتج المحلي الإجمالي. عندما تكون ملزمة إلى غتب، يمكن ران ربط المستوردات أو إكسبورتينس. عند ربط رانغب، إيمبورتينز الإفراج عن حمولتها، في حين أن إكسبورتينز يجب ربط رانغتب لتشكيل مجمع مع البضائع التصدير الخاصة بهم. تعتمد الدولة الملزمة النوكليوتيدات ران على موقعها في نواة (رانغب) أو السيتوبلازم (رانغبد).
في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عددا من الدراسات وجود صلة بين الانهيارات في مسار نوكلوسيتوبلاسميك وكل من التصلب الجانبي الضموري (ألس) والخرف الجبهي الصدغي (فتد) 5 ، 6 </sup> ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ألس هو المرض العصبي التقدمي والقاتل التي تؤثر على كل من الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية (منس) 13 مما أدى إلى الشلل، وفي نهاية المطاف في الموت، في غضون 2-5 سنوات في المتوسط. وتصنف معظم حالات ألس على أنها متفرقة (سالس)، تفتقر إلى أي ارتباط وراثي ظاهر، ولكن 10٪ موروثة بطريقة مهيمنة (ألس العائلي؛ فالس). في الآونة الأخيرة، تم تحديد التوسعات تكرار هيكسانوكليوتيد (هريس) في الكروموسوم 9 إطار القراءة المفتوحة 72 (C9orf72) الجينات 14 ، 15 كسبب وراثي ألس و فتد. هذه المسوخ تمثل 30-40٪ من الحالات فالس 16 ، ودعت دراسات مختلفةأنها تسبب السمية عن طريق التأثير على نقل نوكلوسيتوبلاسميك 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 .
وقد أظهرت هذه الدراسات في الغالب النتائج والمظاهر النهائية لتعليم حقوق الإنسان على النقل نوكلوسيتوبلاسميك، لكنها لا تظهر اضطراب نوكلوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. ونتيجة لذلك، تم تقييم فقط نقص نقل نوكلوسيتوبلاسميك شديد 11 ، 17 ، 18 .
يصف هذا البروتوكول الجديد وري فحص حساسة لتقييم وتحديد العجز النقل نوكليوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. معدل استيراد البروتين نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) يمكن أن يكون كميا في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلورسنت. ويتم ذلك باستخدام مثبط إكسبورتين، كما هو موضح سابقا 18 ، مما يسمح للمكوك غفب فقط لدخول النواة. باستخدام المجهري الفلورسنت والبرمجيات قادرة على قياس التغيرات الفلورية في الوقت الحقيقي، فمن الممكن لقياس التغيرات التدريجية في كثافة مضان المكوك غفب، وتقع في النواة. ونتيجة لذلك، يمكن إجراء منحنى التشبع مثل ميكايليس-منتن مثل محور مضان لوقت، وهو ما يمثل كمية من المكوك النووي غفب في أي وقت من الأوقات. باستخدام المعدل الخطي الأولي للمنحنيات، فمن الممكن لتوليد المنحدر، الذي يمثل معدل الدخول إلى النواة قبل التشبع مضان.
للتحقق من صحة الفحص، ترجمةد C9orf72 يكرر ثنائي الببتيد، بولي (غر) وبولي (بيأر)، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا لتعطيل النقل نوكلوسيتوبلاسميك، استخدمت 5 ، 7 ، 8 ، 10 ، 12 . باستخدام هذا الفحص، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في معدل الواردات النووية مقارنة مع السيطرة. باستخدام هذا النظام، يمكن فحص التغييرات الدقيقة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد قدرة عوامل مختلفة لإنقاذ عيب النقل نوكلوسيتوبلاسميك.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يدل على مقايسة جديدة حساسة وكمية للغاية لتقييم التغيرات الدقيقة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن لمراقبة وقياس النقل نوكلوسيتوبلاسميك واختلال وظيفي في الوقت الحقيقي، وليس فقط العيوب الكبيرة التي تؤدي إلى تغييرات جذرية في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع أعضاء مختبر الذكاء الاصطناعي على تعليقاتهم واقتراحاتهم المفيدة. نود أن نشكر الأستاذ مارك هيب (ماكس معهد بلانك للكيمياء الحيوية) لتزويدنا ناقلات المكوك غفب. وقد تم دعم هذا العمل بمنح مقدمة من مؤسسة العلوم اإلسرائيلية) إيسف رقم 124/14 (، ومؤسسة العلوم الوطنية) بسف # 2013325 (، ومنحة ماري كوري للتكامل الوظيفي) سيغ # 333794 (، والمعهد الوطني لعلم النفس النفسي في إسرائيل) نيبي # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
