Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras
Summary
Este protocolo describe un método para medir sensitivamente la tasa de transporte nucleocitoplasmático dentro de las neuronas motoras NSC-34 células mediante la cuantificación del cambio en tiempo real en la importación nuclear de una proteína NLS-NES-GFP.
Abstract
El transporte nucleocitoplasmático se refiere a la importación y exportación de grandes moléculas del núcleo celular. Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las alteraciones en la vía nucleocitoplasmática. ALS es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las neuronas motoras y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en 2-5 años en promedio. La mayoría de los casos de ELA son esporádicos, carecen de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante. Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HREs) en el gen del gen 72 de lectura abierta del cromosoma 9 (C9orf72) como una causa genética de ALS y demencia frontotemporal (FTD). Es importante destacar que diferentes grupos han propuesto recientemente que estos mutantes afectan el transporte nucleocitoplasmático. Estos estudios han demostrado principalmente el resultado final y las manifestaciones causadas por HREs en el transporte nucleocytoplasmic, pero no demuestran disfunción de transporte nuclear entiempo real. Como resultado, sólo se puede determinar una deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático, principalmente debido a una alta sobreexpresión o inserción de proteínas exógenas.
Este protocolo describe un nuevo y muy sensible ensayo para evaluar y cuantificar la disfunción nucleocitoplasmática de transporte en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se realiza usando un inhibidor de la exportación, permitiendo así que la GFP de la lanzadera sólo entre en el núcleo. Para validar el ensayo, se usaron las repeticiones de dipéptido traducido HRE de C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han mostrado anteriormente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando el ensayo descrito, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Usando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático y la capacidad de diferentes factores para rescatar (incluso parcialmente)Se puede determinar el defecto de soporte.
Introduction
El complejo de poros nucleares (NPC) controla la importación y exportación de moléculas grandes dentro y fuera del núcleo celular. En contraste con las moléculas pequeñas, que pueden entrar en el núcleo sin la regulación 1 , el transporte de moléculas más grandes es fuertemente controlado por el NPC. Estas moléculas grandes, como las proteínas y el ARN, se asocian con factores de transporte, incluyendo importaciones y exportaciones, para ser importados y exportados desde el núcleo 2 . Para ser importados, las proteínas deben contener un pequeño motivo peptídico, generalmente llamado una señal de localización nuclear (NLS), que está limitada por importins 2 . Estas secuencias de aminoácidos actúan como una etiqueta y son diversas en la composición 3 , 4 . Las proteínas pueden ser exportadas desde el núcleo hasta el citoplasma debido a su asociación con laS, que se unen a una secuencia señal, generalmente llamada una señal de exportación nuclear (NES) 2 . Ambos importins y exportins son capaces de transportar su carga debido a la regulación de la pequeña proteína nuclear relacionada con Ras GTPase (Ran) 2 . Ran se ha demostrado que existen en diferentes estados conformacionales dependiendo de si está ligado a GTP o GDP. Cuando se vincula a GTP, Ran puede vincular a importins o exportins. Al unirse a RanGTP, importins liberan su carga, mientras que las exportaciones deben obligar a RanGTP a formar un complejo con su carga de exportación. El estado de enlace de nucleótidos dominante de Ran depende de su ubicación en el núcleo (RanGTP) o el citoplasma (RanGDP).
Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre los trastornos en la vía nucleocitoplasmática y tanto la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) como la demencia frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . La ELA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y fatal que afecta tanto a las neuronas motoras superiores como inferiores (MN) 13 y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en un promedio de 2-5 años. La mayoría de los casos de ELA se clasifican como esporádica (SALS), carece de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante (ALS familiar, FALS). Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HRE) en el gen de lectura abierta del cromosoma 9 72 (C9orf72) 14 , 15 como causa genética de ALS y FTD. Estos mutantes representan el 30-40% de los casos FALS 16 , y diferentes estudios han sostenidoQue causan toxicidad al afectar el transporte nucleocitoplasmático 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Estos estudios han mostrado en su mayoría los resultados finales y las manifestaciones de las ERH sobre el transporte nucleocitoplasmático, pero no demuestran alteración nucleocitoplasmática en tiempo real. Como resultado, sólo se ha evaluado la deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático 11 , 17 , 18 .
Este protocolo describe una nueva y veRy para evaluar y cuantificar la disfunción del transporte nucleocitoplasmático en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se hace usando un inhibidor de la exportación, tal como se ha descrito anteriormente 18 , permitiendo así que la lanzadera-GFP solamente ingrese al núcleo. Utilizando microscopía fluorescente y un software capaz de cuantificar los cambios fluorescentes en tiempo real, es posible cuantificar cambios graduales en la intensidad de fluorescencia de la lanzadera-GFP, localizada en el núcleo. Como resultado, se puede hacer una curva de saturación similar a Michaelis-Menten del eje de fluorescencia a tiempo, que representa la cantidad de enlace-GFP nuclear en un momento dado. Mediante el uso de la tasa lineal inicial de las curvas, es posible generar una pendiente, que representa la tasa de entrada en el núcleo antes de la saturación de fluorescencia.
Para validar el ensayo, el traductorSe utilizaron repeticiones de dipeptidos C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han descrito previamente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Usando este ensayo, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Utilizando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Además, se puede determinar la capacidad de diferentes factores para rescatar un defecto de transporte nucleocitoplasmático.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demuestra un nuevo ensayo altamente sensible y cuantitativo para evaluar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando este sistema, es posible observar y medir el transporte nucleocitoplasmático y su disfunción en tiempo real, no sólo grandes defectos que resultan en cambios dramáticos en la distribución de proteínas. Este ensayo no sólo tiene una ventaja de sensibilidad, sino que también requiere poca preparación, es barato y es un ensayo muy fácil y de bajo compromiso….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio de AI por sus útiles comentarios y sugerencias. Nos gustaría agradecer al Prof. Mark Hipp (Instituto Max Planck de Bioquímica) por brindarnos el vector shuttle-GFP. Este trabajo fue apoyado por las concesiones de la fundación israelí de la ciencia (ISF # 124/14), de la fundación binacional de la ciencia (BSF # 2013325), de la concesión de la integración de carrera de Marie Curie FP7 (CIG # 333794), y del instituto nacional para Psychobiology en Israel NIPI # b133 – 14/15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
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