Summary

Preparazione di vescicole a membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per potenziali terapie di sostituzione del citoplasma

Published: May 18, 2017
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Summary

Le malattie legate all'età sono associate a più difetti nei componenti del citoplasma. Qui presentiamo un protocollo per preparare vescicole a membrana plasmatica dalle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo. Questa tecnica potrebbe essere potenzialmente utilizzata come mezzo di terapia sostitutiva per citoplasma per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età.

Abstract

Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi. La fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondriali ha ripristinato l'attività mitotica in condizioni normali di coltura. L'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro sono malattie legate all'età che sono state riportate per essere associate a più difetti meccanici e funzionali nel citosolo e negli organelli di una varietà di tipi di cellule. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) rappresentano una popolazione cellulare unica dal midollo osseo che possiede capacità di auto-rinnovamento pur mantenendo la loro multipotenza. L'integrazione di cellule di senescenza con giovane citoplasma da BMSC autologhe attraverso la fusione di PMV fornisce un approccio promettente per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età. Questo protocollo descrive come preparare PMV da BMSC tramite estrusione attraverso una membrana policarbonato con 3Determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la conservazione del potenziale delle membrane all'interno di PMV usando un microscopio confocale, concentrare PMV mediante centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.

Introduction

Una grande quantità di sforzi è stata dedicata alla creazione di approcci per terapie di sostituzione di geni, enzimi e cellule. Ciò ha portato a grandi scoperte e persino alle applicazioni cliniche 1 , 2 , 3 . Recentemente, una controversa terapia sostitutiva di mitocondri basata sulla tecnologia di trasferimento del nucleo è stata applicata alla fecondazione in vitro per le donne di età avanzata o con una mutazione letale del DNA mitocondriale 4 . I difetti riscontrati nelle malattie legate all'età, tra cui l'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro, sono di solito multi-faceted. È stato documentato che l'accumulo di gocce lipidiche; La deposizione di proteine ​​amiloide; La conservazione delle proteine ​​dispiegate nel reticolo endoplasmatico; E proteasomi difettosi, autofaggo e mitocondri contribuiscono allo sviluppo o all'aggravamento di queste malattie"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Attualmente, non esiste un meccanismo disponibile per la rimozione diretta del malfunzionamento nel citosolo e negli organi, che provoca senescenza e fenotipi di invecchiamento.

Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi 12 . Ad eccezione del nucleo, i componenti della membrana o del citosolo, tra cui proteine ​​e RNA, nonché gli organelli, come i mitocondri, sono stati trovati nei PMV. In sostanza, un PMV può essere considerato come una cellula enucleata in miniatura. Ancora più importante, la fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondri ha ripristinato l'attività mitotica in normali condizioni di coltura. Questa è la prima relazione su establiUn approccio potenzialmente efficiente per la terapia sostitutiva del citoplasma.

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono cellule progenitrici multipotenti generate genericamente dal midollo osseo e sono facilmente espandibili nella coltura. I marcatori delle cellule staminali embrionali Oct4, Nanog e SOX2 sono stati rilevati a bassi livelli nei MSC 13 . L'attività della telomerasi è anche misurabile. Inoltre, l'assenza di molecole coestimolanti e molecole di Classe II dell'antigene delle cellule umane (HLA), nonché la bassa espressione di HLA di classe I su MSC, li rendono le cellule ideali per l'uso allogeneico o "off-the-shelf" Sia la medicina rigenerativa che le applicazioni immunomodulatorie 14 .

Qui descriviamo come preparare PMV da BMSC del mouse attraverso l'estrusione attraverso una membrana di policarbonato con pori da 3 μm, determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la manutenzione del potenziale delle membrane nei PMV utilizzando confocAl microscopio, preparare PMV concentrati ma non aggregati per centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.

Protocol

I topi BALB / c da 8 a 12 settimane sono stati acquistati da Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Cina) e raccolti in una struttura specifica per gli animali patogeni e climatizzata. La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state conformi agli orientamenti per l'uso e la cura degli animali da laboratorio istituiti dall'Università Shantou. 1. Montaggio dell'apparecchio Per garantire la sterilità, accendere la luce UV di un cofano di tessuto per…

Representative Results

La chiave per una buona preparazione dei PMV dipende fortemente dal corretto montaggio dell'unità filtrante ( Figura 1 ), che può essere testato spingendo 1 mL di PBS attraverso la membrana. Se si verifica una perdita, riassemblare l'unità filtrante e provare nuovamente. Tuttavia, la perdita può essere verificata solo in modo affidabile quando le cellule vengono spinte attraverso la membrana. Se solo pochi PMV vengono rilevati sotto un normale microscopio uti…

Discussion

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Li Ka Shing, il Guangdong University High Level Project "Green Technologies for Marine Industries", la Fondazione della Scienza Naturale della Cina (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) e il Dipartimento per l'istruzione del Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

Materials

IsoporeTM membranes Millipore TSTP04700 3 mm pore
Disposable filter unit Xinya, Shanghai, China 25 mm Medical grade polypropylene
Insulin syringe BD 328446 1 ml
pN1-EGFP Clontech  6085-1
MitoTracker Molecular Probes M7514 Green FM, 1 μM
JC-1 Beyotime, Haimen, China C2006 10 mg/ml
CM-DiI Beyotime, Haimen, China C1036 10 mM
PEI Sigma P3143 Mn = 75000
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE 2000 With CCD camera
Confocol Microscope Carl Zeiss LSM 510 Meta
PolyJet SigaGen SL100688 For cell transfection

References

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Cite This Article
Xu, L., Lin, M., Li, Y., Li, S., Chen, S., Wei, C. Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy. J. Vis. Exp. (123), e55741, doi:10.3791/55741 (2017).

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