潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

Summary

加齢性疾患は、細胞質成分の複数の欠陥に関連している。ここでは、骨髄間葉系幹細胞から原形質膜小胞を調製するためのプロトコールを提示する。この技術は、加齢に関連した表現型を改善する、またはそれを逆転させるための細胞質置換療法の手段として潜在的に使用することができる。

Abstract

私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的押出しによる原形質膜小胞（PMV）の生成について報告してきた。 PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病および癌は、様々な細胞型の細胞質ゾルおよび細胞小器官における複数の機械的および機能的欠陥に関連すると報告されている加齢性疾患である。骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、多能性を維持しながら自己再生能力を有する骨髄由来の独特の細胞集団を表す。 PMVの融合を介した自己BMSCからの若い細胞質による老化細胞の補充は、加齢に関連する表現型を改善する、または逆転させる有望なアプローチを提供する。このプロトコルは、押出によってBMSCからPMVをポリカーボネート膜を介して3つミオソンドリアの存在を判定し、共焦点顕微鏡を用いてPMV内の膜電位の維持を調べ、遠心分離によってPMVを濃縮し、マウスの腓腹筋にPMVのインビボ注入を行う。

Introduction

遺伝子、酵素および細胞置換療法のためのアプローチを確立することに多大な努力が注がれてきた。これは大きなブレークスルー、さらには臨床応用1,2,3をもたらしました。最近、核移植技術に基づいた議論の余地のあるミトコンドリア補充療法が、高齢の女性または致死的ミトコンドリアDNA突然変異を有する女性の体外受精に適用された ⁴ 。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病、および癌を含む、年齢関連疾患に見られる欠陥は、通常多面的である。脂質液滴の蓄積が報告されている。アミロイドタンパク質の沈着;小胞体における折り畳まれていないタンパク質の保持;オートファゴソーム、およびミトコンドリアの欠陥が、これらの疾患の発症または悪化に寄与する"xref"> 5,6,7,8,9,10,11。現在、老化および老化表現型を引き起こす細胞質および細胞小器官における機能不全の直接修復を目的とした利用可能なメカニズムは存在しない。

私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的な押し出しによる原形質膜小胞（PMVs）の生成について報告しています¹² 。核を除いて、膜または細胞質ゾル（タンパク質およびRNAを含む）ならびに細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）の成分が、PMVにおいて見出された。本質的に、PMVは小型除核細胞とみなすことができる。さらに重要なことに、PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。これは、最初の報告書です。潜在的に効率的な細胞質補充療法のアプローチを提案している。

骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、骨髄から日常的に生成され、培養において容易に増殖する多能性前駆細胞である。胚性幹細胞マーカーOct4、Nanog、およびSOX2は、MSCsにおいて低レベルで検出されている¹³ 。テロメラーゼ活性も測定可能である。さらに、MSC上での共刺激分子およびヒト白血球抗原（HLA）クラスII分子の不在および低HLAクラスI発現は、それらを同種異系または「既製品」使用のための理想的な細胞にする再生医療と免疫調節アプリケーションの両方¹⁴ 。

ここでは、3μm孔のポリカーボネート膜を介した押し出しによるマウスBMSCからPMVを調製する方法、ミトコンドリアの存在を決定する方法、およびコンポックを用いてPMVにおける膜電位の維持を調べる方法を説明する遠心分離によって濃縮されたが凝集していないPMVを調製し、マウスの腓腹筋にPMVをインビボで注入する。

Protocol

8〜12週齢のBALB / cマウスをShanghai Experimental Animal Center（上海、中国）から購入し、特定の病原体および空調された動物施設で飼育した。動物のケアおよび実験手順は、汕頭大学によって設立された実験動物の使用およびケアのためのガイドラインに従っていた。 1.装置の組み立て無菌性を確保するために、使用前に組織培養フードのUV光を30分間点灯させます。 </l…

Representative Results

PMVをうまく調製するための鍵は、1mLのPBSをメンブレンに通して試験することができるフィルターユニット（ 図1 ）の正しい組み立てに大きく依存します。漏れが発生した場合は、フィルタユニットを再度組み立て、再度テストしてください。しかし、漏出は、細胞が膜を通って押し出されたときにのみ確実に試験することができる。 10倍の対物レンズを?…

Discussion

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…

Materials

IsoporeTM membranes	Millipore	TSTP04700	3 mm pore
Disposable filter unit	Xinya, Shanghai, China	25 mm	Medical grade polypropylene
Insulin syringe	BD	328446	1 ml
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Molecular Probes	M7514	Green FM, 1 μM
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/ml
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75000
Fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE 2000	With CCD camera
Confocol Microscope	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	For cell transfection