ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.
טכנולוגיות חדשות לנצל המבוסס על נימי immunoassays מבטיח הערכה כמותית יותר ויותר חלבון בהשוואה immunoassays המסורתי. בדומה מבחני נוגדן מבוססי חלבונים אחרים, אופטימיזציה של פרמטרים המבוסס על נימי מתכלה, כגון ריכוז חלבון, דילול נוגדן זמן החשיפה עם זאת, תנאי מוקדם חשוב לדור של אמין ובעל משמעות נתונים. מדידות חייב ליפול בתוך הטווח. ליניארית של וזמינותו איפה לשינויים אות יחסי ישירות לשינויים בריכוז lysate. תהליך בחירת המתאים ריכוזי lysate נוגדנים דילולים, פעמים חשיפה בשורה תאי אפיתל הסמפונות אדם, BEAS-2B, הוא הפגין כאן. ליניאריות assay מוצג על טווח של תאים כל תמצית חלבון ריכוזים עם נוגדנים p53 וα-טובולין. דוגמה של האות שחיקה נתפסת בבית את הריכוזים הגבוהים ביותר עם חשיפה ארוכה פעמים, מעגל דילול של נוגדן α-טובולין מוצג הוכחת רוויה. בנוסף, מדווחים תוצאות ניסויית דוגמה עבור תאים שטופלו דוקסורוביצין באמצעות פרמטרים אופטימליים.
נימי immunoassays electrophoretic ביטוי חלבון lysates תא באמצעות מערכות הפרדה גודל או תשלום וכולן מספקות כמה יתרונות על פני immunoassays המסורתי. לדוגמה, כאשר לעומת תספיג, ההליך ממוכנת המבוססת על נימי מבטלת את הצורך ג’ל, העברת התקנים, ושוטף ידני. בנוסף, כמות החלבון הנדרש המוחלט נמצא כ 10 פעמים פחות, ביצוע מערכות מבוססות נימי אידיאליות לשימוש עם סוגי תאים נדיר או מדגם מוגבל1,2. תוצאות מתקבלים קצת כמו 3 שעות באמצעות מערכות אוטומטיות, בעבר הוכחו להיות כמותיים יותר לשחזור מאשר המערבית הקונבנציונלית כתם הליכים3,4,5. תהליך מבוסס-גודל מבחני מורכב טעינה בדגימות המכיל נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), dithiothreitol (DTT), ומתויגים fluorescently משקל מולקולרי סמני לתוך עמודות נימי המכיל סידור בערימה והפרדה מטריצות. מתח חלה על הנימים מפריד את החלבונים הדגימות בהתאם לגודל, אור UV עוצר את החלבונים מופרדים לקיר נימי. נים זה אז חיסונית-שנבדק עם במטרה העיקרית נוגדן וחזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת. הלומינול ותחמוצת המימן לעודד דור אור chemiluminescent, אשר נמדדת מצלמה בשילוב התקן (CCD) תשלום, ניתח quantitate חלבון.
למרות בקלות יחסית המהירות של פלטפורמת מיכשור וציוד electrophoretic אוטומטית מבוססת-נימי, אופטימיזציה של assay תנאים כגון ריכוז חלבון, דילול נוגדן זמן החשיפה חשובה להשגת מדויק, לשחזור תוצאות. באופן כללי, הפרוצדורות הבאות יש לבצע כדי למטב וזמינותו של מערכות אלה:
1) מסך צריכה להתבצע להעריך ולבחור נוגדנים עבור האות וספציפיות אל המטרה חלבון. אם הוא זמין, חלבון מטוהרים או היעד epitope ניתן להשתמש כדי להעריך ירידה לפרטים; עם זאת, עדיין חשוב להעריך את פוטנציאל אות לא ספציפית הכוללת חלבון הטרייה מערכת מודל.
2) הבא, הטווח הדינמי של וזמינותו צריך להיקבע. במצב אידיאלי, לסמן הכפלה (נמדד בעזרת שיא) נצפית כמו ריכוז מדגם מוכפל; עם זאת, בפועל, שינוי ביחס אות קלט באופן צפוי (למשל, לינאריות מתאים) מספיקה על כימות חלבון. בנוסף, מיטוב זה מגדיר את ריכוז חלבון קליטה גבוהה אך עדיין בתוך הטווח. ליניארית עבור דגם ניסיוני.
3) לקבוע ריכוז נוגדן אופטימלית באמצעות ריכוז חלבון קבוע נבחר אופטימיזציה בשלב 2. ריכוז נוגדן גודלת, האות מגדיל עד זה מישורים-רוויה. ריכוז נוגדן ליד רמת רוויה זו נדרשת עבור מדידה מדויקת של ריכוז חלבון.
התהליך המשמש כדי למטב את ריכוז חלבון נוגדן דילולים, פעמים חשיפה וזמינותו גודל אוטומטי המבוסס על נימי6 הוכח באמצעות תמציות התא כולו מבודד BEAS-2B, אדם SV-40 טרנספורמציה הסימפונות שורת תאים אפיתל. בידוד חלבון של תמציות תאים או רקמות יכול להתבצע באמצעות מספר פרוטוקולים שפורסמו7,8,9 , לא יכוסו כאן. התוצאות של ניסוי הניסיון להשתמש בתנאים אופטימליים גם דיווחו על סך ובעלות phosphorylated (סרין 15, סרין 20) p53 בתרבויות נחשפים דוקסורוביצין (נפוץ כימותרפיות סוכן אשר מעוררת אפופטוזיס תא10) ב- 1.2, 1.8, ו 2.4 מדיה µg/mL עבור 4 h לפני הקציר. האזורים שיא p53 הם מנורמל ל ɑ-טובולין, אשר משמש פקד הטעינה.
במשך עשורים, היו מתמשכת ההתעניינות בפיתוח שיטות מתכלה electrophoretic המבוסס על נימי עקב נמוך ריאגנט ולדגום ההוצאה, ירד עיבוד זמן בהשוואה לשיטות מסורתיות וגבוה תאימות ל להפוך לאוטומטיות הליך ה-4,15. ישנם מספר פרוטוקולים שונים עבור הפרדת חלבונים אשר נעזרו נימים, כולל פולימר electrophoretic, electrokinetic, ניפוי, ושיטות לגירויי כאב, אשר לבודד חלבונים לפי מאפיינים שונים (בהתאמה, מטען אלקטרוסטטי, שיווי משקל המחיצה, ניפוי מאפיינים של מטריקס הפרדת, ו pH)16. כאן, אנו מתארים של השיטה אלקטרופורזה נימי נוגדן מבוסס (או מתכלה), באמצעות פולימר ניפוי הפרדה, יש כבר אוטומטי ומסחרית המאומץ3. היתרונות של מערכת זו כולל קלות שימוש, מבצע, ריאגנטים סטנדרטית ו זמינים מסחרית, מדידות אמין, רגיש הדורשים פחות ריאגנט ודוגמאות לעומת מבחני חלבון מסורתיים כגון, תספיג חלבון מקושרים-אנזים מתכלה, ועוד פורמטים3,4,5. זה נרשמה בהערכות קודמות של טכנולוגיה זו כי הטווח בגודל של חלבון זה יכול להיות מוערך יש היה מוגבל על-ידי הפרדה זמין מטריקס4ההנפקות אולם האחרונות הרחיבו את טווח מדידה 2 440 kDa17 . בנוסף, כמה מאגרי lysate ידועים להיות תואם ל- assay18, ולכן מבחר ריאגנטים ניסיוני המשמש יש לקחת בחשבון מראש.
היתרון העיקרי של הליך אוטומטי עם רכיבים זמינים מסחרית היא עקביות של תוצאות באמצעות שיטות מתוקננת, ריאגנטים. פעולה זו מקטינה את הסיכוי לכשל assay על ידי מיכון שלבים קריטיים בתוך השגרה. עם זאת, חשוב לציין כי פרקטיקות מסוימות חייב להיות דבקה במהלך פרוטוקול כדי למזער בעיות מיכשור וציוד נימי מבוסס על electrophoretic. קודם, זה קריטי כי התערובת הלומינול-S/מי חמצן מוכן טרי ומיד לפני צלחת טעינה. תזמון עקבי תגרום לומינסנציה עקבי אחרי הסוכן חמצון נוסף, אשר תגרום המידות עקבית עבור וזמינותו נוגדנים מסוימים לאחר assay. יתר על כן, חשוב כי ריאגנטים שפג תוקפו שאינם משמשים, אשר משפיע בעיקר את העוצמה של סוכן חמצון. בנוסף, חשוב כי סדר טעינה של דגימות, נוגדנים, וחומרים אחרים אך ורק לאחר מכן (ראה איור 1). כל ריאגנט pipetted מהמקום יביא כשל assay, ריצה מבוזבז.
מלבד השלבים הקריטיים, בעיות העיקרי חוו עם הטכניקה ניתן בדרך כלל להתגבר באמצעות אופטימיזציה. אכן, תנאים אלה ספציפיים לכל שילוב מערכת/נוגדן מודל, לכן צריך להיות נחוש מדעית עבור כל assay חדש. במאמר זה, אנו מתמקדים שלושה הליכים אופטימיזציה נפוצות: זמן החשיפה טיטור lysate, דילול נוגדן ראשוני. היכולת להפיק תוצאות הניתנות למדידה תלוי ניתוח של מועד החשיפה כאשר המצע הלומינול לא להיות במהירות תיגמר, כתוצאות המצע דלדול לאובדן של האות. טיטור lysate קובע את הטווח הדינמי ליניארי של כל assay, שיכול להיות שונה עם מערכות מודל שונה, כמו גם נוגדנים שונים, אפילו בשביל חלבון לאותו היעד. נוגדן דילולים שבחרת ליד קולח ריכוזי או להבטיח שינויים אות לא יושפעו על ידי מחסור נוגדן חינם, אלא רק על ידי כמות חלבון זמין היעד epitope שונות. שיקולים אחרים במהלך תהליך אופטימיזציה עשויים לכלול זמן הדגירה נוגדן ודגימת לערום/זמן טעינה. ברוב המקרים הגדרות ברירת המחדל עבור הכלי מציעים את האיזון הטוב ביותר של רזולוציה ורגישות. עם זאת, במקרים מסוימים, רזולוציה נמוכה או רגישות ניתן לשפר באמצעות התאמת הפרמטרים האלה.
ראגנטים נימי electrophoretic מבוססי שיטות מספקים מדידות חלבון מהיר, יעיל, ו לשחזור. שיטות אלה כבר נעזרו בעיקר בהגדרות מחקר ופיתוח, מרקם של טכנולוגיות אלה יש פוטנציאל השירות יישומים קליניים ולניהולו. לדוגמה, זיהוי subpopulations רגישים חשיפה לרעלים סביבתיים או חולים עם התקדמות המחלה יכול להיות מבוסס על חלבון סמנים ביולוגיים נמדד מטריצות נגישים, כגון דם, שתן ורוק. ריאגנט של ירידה במחיר מבצע, מספר מטרות שניתן המוערך בו זמנית מגביר ודוגמאות, שנראה סביר מתכלה נימי electrophoretic המבוסס על שיטות המשמשות עבור סוגים אלה של יישומים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות קית Tarpley אותנו לאיכות הסביבה במשרד ראש צוות פיתוח, מחקר, פיתוח-Research Triangle Park (ORD-RTP) גרפיקה ומדיה מדביק, ועריכה של וידאו הדרכה. כן נרצה להודות דבורה פריטצ’ט מ ProteinSimple לשיחות מועיל לגבי אופטימיזציה של הנתונים שלנו,. JM Guynn נתמכה על ידי המכון אוק רידג המדע, החינוך תוכנית מחקר/השתתפות ב לנו מסוכנות ההגנה על הסביבה.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |