Se demuestra un inmunoensayo de capilar usando una plataforma comercial para medir las proteínas blanco de preparaciones de proteínas totales. Además, parámetros de ensayo del tiempo de exposición, concentración y dilución de anticuerpo están optimizados para un sistema de modelo de cultivo celular.
Nuevas tecnologías que utilizan inmunoensayos basados en tubo capilar prometen evaluación más rápido y más cuantitativa de proteína comparado con inmunoensayos tradicionales. Sin embargo, otros ensayos basados en anticuerpos de la proteína, optimización de parámetros de inmunoensayo basado en el tubo capilar, tales como concentración de proteína, dilución de anticuerpo y tiempo de exposición es un requisito previo importante para la generación de significativos y confiables datos. Las mediciones deben estar dentro del rango lineal del ensayo donde los cambios en la señal son directamente proporcionales a los cambios en la concentración de lisado. El proceso de elección de las concentraciones adecuadas de lisado, las diluciones de anticuerpo y tiempos de exposición en la línea de células epiteliales bronquiales humanas, BEAS-2B, se demuestra aquí. Linealidad de ensayo se muestra en un rango de concentraciones de proteína Extracto de células enteras con anticuerpos p53 y α-tubulina. Un ejemplo de quemadura de la señal se ve en las concentraciones más elevadas con tiempos de exposición largos, y se muestra una curva de dilución de anticuerpo de α-tubulina demostrando saturación. Además, se reportan resultados experimentales ejemplo para células tratadas con doxorrubicina con parámetros optimizados.
Inmunoensayos electroforéticos capilares medida expresión de la proteína en los lysates de la célula utilizando sistemas de separación de tamaño o carga y ofrecen varias ventajas sobre el tradicionales inmunoensayos. Por ejemplo, en comparación con western blot, el procedimiento automatizado basado en el tubo capilar elimina la necesidad de geles, dispositivos de transferencia, y lavado manual. Además, la cantidad absoluta de proteínas necesaria es aproximadamente 10 veces menos, haciendo sistemas de tubo capilar ideal para el uso con tipos raros de la célula o limitada muestra1,2. Resultados se obtienen en tan sólo 3 h utilizando sistemas automatizados y anteriormente se han demostrado para ser más cuantitativa y reproducible que convencional occidental blot procedimientos3,4,5. El proceso de ensayos de tamaño consiste en cargar las muestras que contienen sulfato de sodio dodecyl (SDS), dithiothreitol (DTT) y fluorescencia con la etiqueta marcadores de peso molecular en columnas capilares que contienen matrices de apilamiento y de separación. Voltaje aplicado a los tubos capilares separa las proteínas en las muestras según el tamaño, y la luz UV inmoviliza las proteínas separadas de la pared capilar. El capilar es inmuno-sondeado con destino específico primaria rábano picante y el anticuerpo peroxidasa (HRP)-anticuerpo secundario conjugado. Luminol y peróxido de catalizan la generación de luz quimioluminiscente que es medido por una cámara de carga dispositivo acoplado (CCD) y analizada para cuantificar proteínas.
A pesar de la relativa facilidad y velocidad de una plataforma automatizada basada en tubo capilar electroforético inmunoensayo, optimización de condiciones de ensayo como el tiempo de exposición, dilución de anticuerpo y la concentración de proteína es importante para la obtención precisa y reproducible resultados. En general, los siguientes procedimientos se deben realizar para optimizar un análisis para estos sistemas:
1) una pantalla se debe realizar para evaluar y elegir los anticuerpos para la señal y especificidad a la meta de proteína. Si está disponible, proteína purificada o epitopo de destino puede utilizarse para evaluar la especificidad; sin embargo, sigue siendo importante evaluar potencial señal inespecífica en proteína total proviene del sistema modelo.
2) a continuación, el rango dinámico del ensayo debe ser determinado. En una situación ideal, señal de doblar (medido mediante el área de pico) se observa como se duplica la concentración de la muestra; sin embargo, en la práctica, un cambio proporcional en la señal de entrada de manera predecible (p. ej., linear fit) es suficiente para la cuantificación de proteína. Además, esta optimización define la concentración de proteína con alta señal, pero todavía dentro del rango lineal para el modelo experimental.
3) determinar la concentración óptima del anticuerpo con la concentración de proteína fijo elegida en el paso 2 de la optimización. Como la concentración de anticuerpos aumenta, la señal aumenta hasta mesetas en saturación. Una concentración de anticuerpo cerca de este nivel de saturación es necesaria para una medición precisa de la concentración de la proteína.
El proceso utilizado para optimizar las concentraciones de proteína, las diluciones de anticuerpo y tiempos de exposición para un tamaño basado en el tubo capilar automatizado análisis6 se demuestra usando los extractos de células enteras aislados de BEAS-2B, un humano de SV-40 transformado bronquial línea de células epiteliales. Aislamiento de proteínas de los extractos de célula o tejido se puede realizar usando un número de protocolos publicados7,8,9 y no se tratarán aquí. Resultados de un experimento de prueba usando las condiciones optimizadas son también registrados por total y fosforila p53 (serina 15, serina 20) en cultivos expuestos a doxorrubicina (un agente quimioterapéutico común que induce la apoptosis de la célula10) en 1.2, 1.8, y media de 2,4 μg/mL para 4 h antes de la cosecha. Las áreas de pico de p53 se normalizan para ɑ-tubulina, que se utiliza como un control de carga.
Durante décadas, ha habido interés sostenido en el desarrollo de métodos de inmunoanálisis basados en electroforesis capilar debido a baja muestra y reactivo de gasto, disminuido de procesamiento tiempo comparado con los métodos tradicionales y alta compatibilidad automatizar el procedimiento4,15. Hay un número de diferentes protocolos para la separación de las proteínas que han utilizado los capilares, como polímero electroforético, electrocinético, tamizado y métodos isoeléctricos, que aislar proteínas de diferentes propiedades (respectivamente, carga electrostática, equilibrio de partición, tamizado de propiedades de la matriz de separación y pH)16. Aquí, describimos un método de electroforesis capilar basados en anticuerpos (o inmunoensayo), utilizando un polímero tamizado separación, que ha sido automatizado y comercialmente adoptado3. Las ventajas de este sistema incluyen facilidad de uso y operación, reactivos estandarizados y disponibles en el mercado y mediciones fiables y sensibles que requieren menos reactivo y las muestras en comparación con ensayos de proteínas tradicionales como la western blot inmunoensayo ligado a enzimas y otros formatos de3,4,5. Se ha observado en las evaluaciones previas de esta tecnología que la gama del tamaño de la proteína que puede ser evaluada ha sido limitada por la separación disponible matriz4, ofertas sin embargo recientes han ampliado la gama de valores medibles de 2 a kDa 44017 . Además, algunos buffers lisados son conocidos por ser incompatible con el ensayo18, por lo tanto selección de los reactivos experimentales usados debe considerarse previamente.
Una ventaja importante de un procedimiento automatizado con componentes disponibles en el mercado es la consistencia de resultados a través de métodos estandarizados y reactivos. Esto minimiza las posibilidades de fracaso de ensayo mediante la automatización de pasos críticos en el procedimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ciertas prácticas deben respetarse durante el protocolo para minimizar los problemas con el inmunoensayo basadas en electroforesis capilar. En primer lugar, es crítico que la mezcla de luminol-S/peróxido se prepara fresco e inmediatamente antes de placa de carga. Constante tiempo resultará en luminiscencia constante después de agrega el agente oxidante, que dará como resultado mediciones constantes para un ensayo determinado anticuerpo después de ensayo. Además, es importante que se utilicen reactivos no caducados, que afecta sobre todo a la potencia del agente oxidante. Además, es importante que el orden de carga de muestras, anticuerpos y otros reactivos estrictamente seguida (ver figura 1). Cualquier reactivo pipetea fuera de lugar resultará en fracaso de ensayo y una carrera desperdiciada.
Además de estos pasos críticos, temas primarias experimentadas con la técnica generalmente pueden ser superados mediante optimización. De hecho, estas condiciones son específicas para cada combinación de sistema anticuerpos de modelo y por lo tanto deben determinarse empíricamente para cada nuevo ensayo. En este artículo, nos centramos en tres procedimientos comunes de optimización: tiempo de exposición, valoración lisado y dilución del anticuerpo primario. Depende de la capacidad para generar resultados medibles en el análisis de un tiempo de exposición cuando el sustrato del luminol no es ser rápidamente agotado, como resultado de agotamiento de sustrato en pérdida de señal. Valoración lisado determina el rango dinámico lineal de cada ensayo, que puede variar con diferentes modelo de los sistemas, así como diversos anticuerpos, incluso para el mismo objetivo de proteína. Las diluciones de anticuerpo elegidas en o cerca de concentraciones de saturación garantizar cambios en la señal no será afectados por la escasez de anticuerpos libres, pero sólo por diferentes cantidad de proteína disponible objetivo del epítopo. Otras consideraciones durante el proceso de optimización pueden incluir tiempo de incubación del anticuerpo y apilamiento/carga de la muestra. En la mayoría de los casos la configuración por defecto para el instrumento ofrece el mejor equilibrio entre sensibilidad y resolución. Sin embargo, en algunos casos, mala resolución o sensibilidad puede mejorarse mediante el ajuste de estos parámetros.
Métodos de inmunoensayo basadas en electroforesis capilar ofrecen las mediciones de proteína rápida, eficiente y reproducible. Mientras que estos métodos se han utilizado principalmente en entornos de investigación y desarrollo, la coherencia de estas tecnologías tiene utilidad potencial en usos clínicos y regulatorios. Por ejemplo, la identificación de subpoblaciones sensibles a tóxicos medioambientales o en pacientes con progresión de la enfermedad puede basarse en proteínas biomarcadores medidos en matrices de acceso, tales como sangre, orina y saliva. Como reactivo y caída de los costos de operación y el número de muestras y blancos que pueden ser evaluados al mismo tiempo aumenta, probablemente veremos métodos de inmunoanálisis basados en electroforesis capilar utilizados para este tipo de aplicaciones.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer Keith Tarpley de la EPA oficina de equipo de investigación y desarrollo-Research Triangle Park (RTP-ORD) gráfica y los medios de comunicación para el desarrollo, grabación y edición de video instructivo. También nos gustaría dar las gracias a Deborah Pritchett de ProteinSimple para mantener conversaciones útiles con respecto a la optimización de nuestros datos de. Guynn JM fue apoyado por el Instituto de Oak Ridge para la ciencia y el programa de Educación de la investigación y la participación en la Agencia de protección ambiental de nosotros.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |